序貫設計優化大豆多肽制備工藝

潘進權，花偉誠，劉燕梅，梁玉嫦

（湛江師范學院生命科學與技術學院，廣東 湛江 524048）

大豆多肽是指大豆蛋白經蛋白酶水解作用后，得到的低聚肽混合物。由于經過了蛋白酶的水解作用，大豆多肽的溶解性、黏度、乳化力、起泡力等食品加工特性均明顯優于大豆蛋白，具有更廣泛的應用[1-2]。例如，大豆多肽分子量小，水溶性很高，因此，它作為食品原料，具有低黏度、速溶、無殘渣等特點；由于大豆多肽加熱不產生凝固現象，在pH 4.3（大豆蛋白等電點）下不產生沉淀，黏度隨濃度升高變化不大，可開發蛋白飲料和高蛋白果凍。此外，眾多的研究發現，大豆多肽具有抗氧化、增強免疫力、降血壓、減肥等多種生理功能[3]。因此，大豆多肽作為一種新型的功能性食品原料具有很好的開發潛力。

從已有文獻報道來看，在大豆蛋白水解制備多肽的工藝中，應用堿性蛋白酶的效果明顯優于中性或酸性蛋白酶，這應該與大豆蛋白在堿性條件下可溶的特點有一定的關系[4-5]。然而，在蛋白水解過程中，隨著肽鍵的打開，水解液的pH會有所下降，堿性蛋白酶的活性將降低，大豆蛋白的溶解度也會下降從而限制了大豆蛋白的水解[5]。為了維持水解液的pH穩定，使其有利于酶的作用及蛋白水解，在以往的工藝中，都會連續加堿來控制體系的pH，甚至是采用pH緩沖劑的方法。這樣雖然可以在一定程度上提高蛋白水解效率，但是在水解液中會殘留大量的無機鹽。為了產品的使用安全，在產品的下游處理過程中必須增加繁瑣的脫鹽工序。這在很大程度上增加了產品的成本。鑒于此，本文考察了在沒有外加堿的pH漸變條件下，大豆蛋白的水解過程，擬建立一種新的大豆多肽制備工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

大豆分離蛋白（蛋白質含量99%）購自萊州?？蜕锛夹g公司，Alcalase蛋白酶購自諾維信公司，試驗中所用其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

B-260型恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠；AUY120型電子天平：日本島津；723N型可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；LXJ-ⅡB型離心機：上海安亭科學儀器廠；LGJ-18型真空冷凍干燥機：北京四環科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 大豆多肽制備基本流程

1.3.2 蛋白酶活性的測定

采用Folin酚法[6]：1.5 mL離心管中加入0.3 mL適當稀釋的酶液及0.3 mL 1.5%酪蛋白（溶于0.05 mol/L pH7.5的磷酸鹽緩沖液），40℃反應10 min，加0.6 mL 0.4mo1/L的三氯乙酸終止反應，靜置15min后14000g離心10 min，取上清液0.6 mL，加入3 mL 0.4 mol/L碳酸鈉溶液及0.6 mL福林酚試劑，于40℃顯色20 min，于680 nm測定其吸光值，根據標準曲線計算酶活單位。

酶活定義：試驗條件下，每分鐘水解酪蛋白釋放出1μg當量酪氨酸所需的酶量為1個活力單位。

1.3.3 水解度的測定

大豆蛋白水解度值采用氨基酸態氮含量來表示，用茚三酮顯色的方法來測定[7]。取適當稀釋后的蛋白水解液0.40 mL于試管中并加入1.60 mL蒸餾水和1.00mL茚三酮顯色劑混勻后置于沸水浴中加熱15min。冷卻后加入5.00 mL 40%乙醇溶液混勻，放置15 min，同時作試劑空白。以試劑空白為參比于570 nm測定樣品顯色液的吸光度值。根據標準曲線（以甘氨酸為標準物）計算蛋白水解液中氨基酸態氮的含量（mg/mL）。由此計算出樣品的水解度：

式中：DH為樣品的水解度值，（mg/100 g）；C為在標準曲線上所查得的測試樣中氨基酸態氮的濃度，（mg/mL）；n為蛋白水解液的稀釋倍數；m為水解前樣品中蛋白的濃度，（g/mL）。

1.3.4 多肽得率計算

式中：m為水解液經冷凍干燥后的質量，g；w為水解液中原大豆蛋白的質量，g。

1.3.5 大豆蛋白的水解

用蒸餾水配制濃度5%的大豆蛋白，并調節pH到9.0，然后置于沸水浴中熱處理15 min。冷卻后按照酶與底物比2000kat/g加入Alcalase蛋白酶，置于50℃下保溫酶解5 h。酶解結束后調節水解液的pH到5.0并煮沸滅酶5 min，于5000 r/min離心10 min，所得上清即為蛋白水解液。以上是大豆蛋白水解的基本方法，試驗過程中將根據試驗設計方案對其中相關參數進行調整。

1.3.6 單因素試驗

蛋白濃度對水解度的影響：用蒸餾水分別配制不同濃度（1%～8%）的大豆蛋白溶液，然后按照1.3.5的方法進行水解試驗，測定各水解液的水解度。

起始pH對水解度的影響：用蒸餾水配制濃度5%的大豆蛋白，并分別調節其pH到8.0～12.0的范圍，然后按照1.3.5的方法進行水解試驗，測定各水解液的水解度。

酶解溫度對水解度的影響：按照1.3.5的方法分別在不同的溫度（40、45、50、55、60、65 ℃）下進行水解試驗，測定各水解液的水解度。

加酶量對水解度的影響：按照1.2.4的方法，分別以不同的酶與底物比（750、1000、1500、2000、3000、4000、5000 kat/g）加入不同量的Alcalase蛋白酶，進行水解試驗，測定各水解液的水解度。

水解時間對水解度的影響：按照1.3.5的方法進行水解試驗，測定不同水解時間水解液的水解度。

1.3.7 部分析因設計

根據上述單因素試驗的結果可初步確定水解工藝中各單一因素的合適取值范圍。在此取值范圍內，利用minitab統計軟件，采用其中的2水平試驗設計，對上述各因素做進一步的分析，由此確定它們對大豆蛋白水解影響的顯著程度，并初步考察各因素間的交互作用。

1.3.8 響應面設計

利用SAS統計軟件，采用響應面分析法中的中心組合設計[8]，對部分析因設計中篩選的顯著因素做進一步考察，以確定其最合適的取值，并由此確定大豆蛋白水解的最佳工藝條件。

1.3.9 試驗設計和統計分析

本試驗采用序貫試驗設計原理[9]，其基本思路就是將多種試驗設計方法，包括單因素試驗、部分析因設計，爬坡設計及中心組合設計有序的結合起來。首先，采用單因素試驗初步考察對結果有影響的因素，并確定各因素的合適取值范圍；然后通過部分析因設計篩選對試驗結果有顯著影響的因素，并利用爬坡設計尋求合適的試驗空間（以確保在該試驗空間中存在最大響應或最小響應點），最后通過中心組合設計以確定在該試驗空間的最大或最小響應點（即確定最佳試驗條件）。本試驗的設計及數據分析采用miniTAB 14和SAS 9.0統計分析軟件。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

采用單因素試驗的方法初步考察了起始pH、溫度、水解時間、加酶量、大豆蛋白濃度對水解度的影響。結果（圖表未列出）表明：以上各因素對于Alcalase蛋白酶水解大豆蛋白均有一定的影響，在不同的條件下進行水解試驗大豆蛋白的水解效率有所差異。相對而言，水解試驗在 pH 10.0～11.0、溫度 50℃～55℃、大豆蛋白濃度5%～6%、加酶量2000 kat/g～3000 kat/g蛋白、水解時間5 h～7 h，大豆蛋白的水解效果較好。

2.2 部分析因設計

采用部分析因設計的方法對單因素試驗中考察的因素做了進一步的分析，以此確定各因素對大豆蛋白水解的影響程度，以及各因素間的交互作用。根據單因素試驗結果設計了部分析因設計各因素的水平，表1、2及表3分別給出了部分析因設計的因素水平、試驗設計結果及結果的回歸分析。

表1 部分析因試驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels of fractional factorial design

從表3的分析結果可以看出：考察的5個因素對大豆蛋白水解的影響程度有明顯的差異；其中大豆蛋白濃度（D），酶與底物蛋白比（E）對大豆蛋白的水解有極顯著的影響（p＜0.01）；水解溫度（C）對大豆蛋白水解有顯著的影響（p＜0.05）；起始pH及水解時間對大豆蛋白水解的影響不顯著（p＞0.1）；另外，A·C、A·E、B·C、B·D及C·E的交互作用對大豆蛋白水解也有顯著的影響。試驗結果的曲率分析顯示，部分析因設計確定的試驗空間是一極顯著曲面響應（Ct Pt＝0.000＜0.01），其中必存在最大或最小響應點。為了確定此試驗空間內的極值響應點，后續的試驗將以因素D及E為對象，在表1所示的各因素水平的取值范圍內進行中心組合試驗設計及響應曲面分析，在此同時固定因素A、B和C的取值為中水平。

2.3 中心組合設計

在以上部分析因試驗結果的基礎上進行了中心組合試驗設計，考察了大豆蛋白濃度（D），酶與底物蛋白比（E）兩者的相互作用及對大豆蛋白水解的影響，試驗設計及結果如表4所示。

表2 部分析因試驗設計及結果Table 2 Test design and results of fractional factorial design

表3 部分析因試驗結果的回歸分析Table 3 Regression analysis of fractional factorial design

表4 中心組合試驗設計及結果Table 4 Design and results of central composite design

對表4的試驗結果進行回歸分析，可以擬合得到以下數學模型：

分析表明，回歸模型具有極高的顯著性（p=0.008＜0.01），該模型可以對試驗結果進行較好的擬合。圖1、2分別給出了擬合模型的響應曲面及等高線圖，曲面的形狀及相應的等高線圖說明在所選取的試驗空間中存在最大響應值。利用SAS軟件分析確定了該最大響應值為（39.10±0.78）mg/100 g，其對應的因素取值分別為：大豆蛋白濃度4.92%、酶與底物蛋白比為2758kat/g蛋白、溫度55℃、起始pH11.0、水解時間7h。

圖1 響應面圖:因素D與E對大豆蛋白水解的影響Fig.1 Response surface:effects of factor D and E on hydrolysis of soy protein

在優化的條件下進行大豆蛋白水解試驗，將蛋白水解液進行冷凍干燥，測定了多肽的得率。結果顯示，在優化條件下進行的大豆蛋白水解，其多肽的得率可達63.21%。

圖2 等高線圖：因素D與E對大豆蛋白水解的影響Fig.2 Contour map:effects of factor D and E on hydrolysis of soy protein

3 結論

采用序貫設計的方法對pH漸變條件下Alcalase蛋白酶水解大豆蛋白制備多肽的工藝進行了探討：首先采用單因素試驗考察了底物濃度、起始pH、溫度、酶濃度、酶解時間對大豆蛋白水解的影響，初步確定了各因素的合適取值范圍；在此基礎上設計了部分析因試驗，進一步分析了以上各因素對大豆蛋白水解影響的顯著程度，并篩選出顯著性影響因子；最后采用中心組合設計的方法對篩選的因素進行了考察，并由此確定了最佳的酶解工藝條件：大豆蛋白濃度4.92%、酶與底物蛋白比為2758 kat/g蛋白、溫度55℃、起始pH 11.0、水解時間7 h。在優化的工藝條件下進行了大豆蛋白水解，大豆蛋白的水解度可以達到39.10 mg/100 g，多肽得率為63.21%。這一結果雖說略低于同類文獻報道[10]，但是由于該工藝所得產品基本上不需要進行后續的脫鹽處理，工藝更為簡單，生產成本可能會更低。綜合來看，在pH漸變條件下，采用堿性蛋白酶酶解制備大豆多肽具有可行性。

[1]張延坤.大豆多肽在食品工業中的應用 [J].食品工業,1997,(3):25-29

[2]劉靜,張光華.蛋白酶解大豆多肽的理化特性[J].華僑大學學報:自然科學版,2010,31(3):302-306

[3]江河源,呂飛杰,邰建祥.大豆生物活性成分及其功能[J].大豆科學,2000,19(2):160-161

[4]劉靜,陳均志.微波雙酶協同水解植物蛋白制備小分子肽的研究[J].食品研究與開發,2006,27(8):9-13

[5]潘進權,羅曉春,謝明權.毛霉蛋白酶的組分特性及對大豆蛋白水解的研究[J].中國糧油學報,2009,24(5):31-35

[6]Sierecha J K.Purification and partial characterization of a neutral protease from a virulent strain of Bacillus cereus[J].The international journal of biochemistry&cell biology,1998,30(5):579-595.

[7]劉靜,李祥,張光華.加熱雙酶聯合水解大豆蛋白的研究[J].中國釀造,2008(12):38-41

[8]劉博群,林松毅,于志鵬,等.基于響應面法優化蛋清蛋白質降壓肽的制備工藝[J].食品科學,2009,30(16):172-176

[9]潘進權,羅曉春,王菊芳,等.基于序貫設計的毛霉AS3.2778發酵產蛋白酶工藝優化[J].食品科學,2008,29(12):481-485

[10]吳瓊,程建軍,楊秋萍,等.堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白的研究[J].食品工業科技,2009,30（10）：191-193