甘草多糖提取純化工藝研究

王振強，申森，樊欣

（1.黃河水利職業技術學院，河南 開封 475003；2.開封第一人民醫院，河南 開封 475001）

甘草（Glycyrrhiza）屬多年生草本植物，主要產于新疆、內蒙、山西、甘肅、陜西等地，常用中草藥，有中草藥之王的美譽，是我國傳統的“藥食兼用”中藥材料。近年隨著人們對甘草多糖認識的提高，人們發現多糖參與了細胞的多種生命現象的調節，如免疫細胞間信息的傳遞和感受，具有多種保健功能，在醫藥、食品、工業等方面得到廣泛應用。因此，開展甘草多糖提取工藝研究具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

甘草：市售；甲醇、無水乙醇、苯酚（以上均為分析純）：天津北方天醫化學試劑廠；硫酸（分析純）：文達稀貴試劑化工廠；甲醇（色譜純）天津大學科威公司。

1.2 儀器與設備

YP型電子天平：上海天平儀器廠；LSY電熱恒溫水浴鍋：北京醫療設備廠；DG404真空電熱干燥箱：天津市天宇實驗儀器有限公司；LG16-W離心機：北京醫用離心機廠；QL-901微型漩渦混合器：其林貝爾儀器制造公司。

1.3 方法

1.3.1 甘草多糖測定方法

采用苯酚-硫酸比色法測定甘草多糖。

1.3.2 測定原理

多糖被濃硫酸在適當高溫下水解，產生單糖，并迅速脫水成糠醛衍生物，在強酸條件下與苯酚起顯色反應，生成橙黃色物質，在波長490 nm處其吸光度A值與糖濃度C呈線性關系，從而可用比色法測定其含量。

1.3.3 標準溶液的配制

稱取干燥的葡萄糖20.00 mg，置500 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度線，搖勻，配得葡萄糖標準溶液。

1.3.4 苯酚溶液的配制

稱取80.0 g苯酚加20.0 g水使之溶解，配制80%苯酚溶液，置于冰箱中避光保存。然后取80%苯酚37.5 mL定容到500 mL，配制成6%的苯酚溶液避光保存備用。

1.3.5 單因素對甘草多糖提取的影響

1.3.5.1 料液比影響

稱取5份甘草粉末各1.0 g，置于250 mL圓底燒瓶中，分別加入 15、20、25、30、35 倍水，100 ℃水浴下，回流提取 1 h，離心分離（5000 r/min，15min），浸提液至100 mL容量瓶蒸餾水定容，取2 mL于10 mL試管中用硫酸-苯酚法測定其吸光度值。

1.3.5.2 提取溫度影響

稱取5份甘草粉末各1.0 g，置于250 mL圓底燒瓶中，各加入 15 倍水，分別在 40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴下，回流提取 1 h，離心分離（5000 r/min，15 min），浸提液至100 mL容量瓶蒸餾水定容，取2 mL于10 mL試管中用硫酸-苯酚法測其吸光度值。

1.3.5.3 提取時間影響

稱取5份甘草粉末各1.0 g，置于250 mL圓底燒瓶中，各加入15倍水，70℃水浴下，分別回流提取0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，離心分離（5000 r/min，15 min)，浸提液至100 mL容量瓶蒸餾水定容，取2 mL于10 mL試管中用硫酸-苯酚法測其吸光度值。

1.3.5.4 提取次數影響

稱取5份甘草粉末各1.0 g，置于250 mL圓底燒瓶中，各加入15倍水，70℃水浴下，分別回流提取1、2、3、4、5、6、7、8 次，每次提取 0.5 h，離心分離（5000 r/min，15 min），浸提液至100 mL容量瓶蒸餾水定容，取2 mL于10 mL試管中用硫酸-苯酚法測其吸光度值。

1.3.6 提取工藝正交試驗因素水平選擇

根據單因素試驗結果，設計正交試驗，確定最佳提取工藝條件見表1。

表1 提取工藝正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal experiment factor level glass

1.3.7 醇沉條件正交試驗因素水平選擇

取粉碎甘草約25 g，按照最優提取條件進行提取，并設計正交試驗見表2。

1.3.8 多糖提取率測定

按照最佳提取工藝進行提取，然后再用醇沉最佳條件進行純化，得出甘草多糖的提取率。

表2 醇沉條件正交試驗因素水平表Table 2 Orthogonal experiment factor level glass

2 結果與分析

2.1 單因素對甘草多糖提取的影響

2.1.1 料液比影響

取粉碎樣品，提取條件為100℃、1 h、提取次數1 次，料液比分別為 1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/g。料液比對甘草多糖提取效果的影響如圖1所示。

圖1 料液比影響Fig.1 Liquid ratio influence

由圖1可以看出，甘草多糖提取量隨料液比的增大而增加。當料液比大于1∶30 g/g時，甘草多糖提取量緩慢降低。

2.1.2 溫度影響

取粉碎樣品，提取條件為料液比1∶15 g/g、提取時間 1 h、提取次數 1 次，溫度分別為 40、50、60、70、80、90、100℃。提取溫度對甘草多糖提取效果的影響如圖2所示。

圖2 提取溫度影響Fig 2 Extraction temperature influence

由圖2可以看出，提取溫度由40℃增加到70℃時，甘草多糖提取量隨溫度的提高而上升，當溫度超過70℃以后，繼續提高溫度，甘草多糖的提取量緩慢下降。

2.1.3 提取時間影響

取粉碎樣品，提取條件為料液比1∶15g/g、溫度70℃、提取次數為 1 次，提取時間分別為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h。提取時間對甘草多糖提取效果的影響如圖3所示。

由圖3可以看出，在提取時間1 h時提取率較高，隨著時間的延長，提取率下降。

圖3 提取時間影響Fig 3 Extraction time influence

2.1.4 提取次數影響

取粉碎樣品，提取條件為料液比1∶15g/g、溫度70℃，提取時間為 0.5 h、提取次數分別為 1、2、3、4、5、6、7、8次。提取次數對甘草多糖提取效果的影響如圖4所示。

圖4 提取次數影響Fig 4 Extraction times influence

由圖4可以看出，隨著提取次數的增加，提取率不斷提高，當增加到6次后，提取率緩慢下降。

2.2 甘草多糖提取條件的正交優化試驗結果

甘草多糖提取條件正交優化試驗結果見表3，方差分析結果見表4。

由表3可知，單因素對提取效果的影響順序為：A>B>C>D，由表4可知，A因素具有顯著性（P<0.05）影響，B、C具有較顯著性（P<0.1）影響，由于D沒有顯著性影響，選取較為節約的條件，提取次數2次，結合甘草多糖提取正交試驗分析結果，甘草多糖提取最佳工藝條件為 A4B1C2D4，即溫度 90 ℃，料液比 1∶30 g/g，時間0.5 h，提取次數2次。按最佳條件進行驗證，甘草多糖提取率為59.80%。

2.3 醇沉條件正交試驗結果

醇沉條件正交優化試驗結果見表5，方差分析結果見表6。

由表5可知，單因素對醇沉條件的影響順序為：A>B>C，由表6可知，A因素具有顯著性（P<0.05）影響，B、C具有較顯著性（P<0.1）影響，結合醇沉條件正交試驗分析結果，最佳醇沉條件為A1B1C3，即乙醇濃度80%，絮凝時間12 h，室溫下醇沉。

表3 甘草多糖提取條件正交試驗設計Table 3 Orthogonal experiment design of Glycyrrhiza polysaccharide extraction condition

表4 正交試驗方差分析結果Table 4 Orthogonal experiment variance analysis result

表5 醇沉條件正交試驗設計Table 5 Orthogonal experiment design of alcohol precipitation

表6 正交試驗方差分析結果Table 6 Orthogonal experiment variance analysis result

3 結論

1）根據甘草多糖提取正交試驗及方差分析結果，單因素對提取效果的影響順序為：溫度>料液比>提取時間>提取次數，其中溫度具有顯著性，料液比和提取時間較顯著，提取次數不顯著；甘草多糖提取最佳工藝條件為 A4B1C2D4，即溫度 90 ℃，料液比 1∶30 g/g，時間0.5 h，提取次數2次。按最佳條件進行驗證，甘草多糖提取率為59.80%。

2）根據醇沉條件正交試驗及方差分析結果，單因素對醇沉條件的影響順序為：乙醇濃度>絮凝時間>醇沉溫度，其中乙醇濃度具有顯著性，絮凝時間和醇沉溫度較顯著，最佳醇沉條件為A1B1C3，即乙醇濃度80%，絮凝時間12 h，室溫下醇沉。

[1]張繼,姚健,丁蘭,等.甘草的利用研究進展[J].草原與草坪,2000(2):12-17

[2]石雪萍.植物多糖研究進展[J].糧食與油脂,2005(8):8-10

[3]孫玉敬,葉柄鴻.多糖研究熱點[J].糧食與油脂,2005(8):3-8

[4]孫萍,李艷,顧承志,等.甘草多糖的微波提取及含量測定[J].基層中藥雜志,2001,15(6):22-23

[5]王航宇,劉金榮,江發壽,等.新疆甘草多糖的超聲提取及含量測定[J].基層中藥雜志,2002,16(1):7-8