響應面法優化Bacillus subtilis NP29產纖維素酶發酵條件的研究

楊麗娜 張 建 龔月生

（西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100）

纖維素（cellulose）是世界上最為豐富的可再生資源和碳水化合物。我國以農作物秸稈為代表的纖維素類資源十分豐富，每年產量可達6億多噸。除反芻動物瘤胃微生物可降解轉化一部分纖維素外，大部分纖維素難以被動物消化利用。同時，由于耕地面積銳減和人口急劇增加，使得人畜爭糧的問題愈加突出。通過微生物產生的纖維素酶降解、利用纖維素資源已經成為當今飼料工業非常規資源開發研究的重點[1-2]。

來源于微生物的發酵產品已經廣泛應用于工業生產和人們生活中，但過高的發酵成本依然制約著發酵工業的發展[3]。因此，如何降低發酵成本成為現代發酵工業的研究熱點。發酵條件的優化是提高微生物產酶量、降低發酵生產成本的重要途徑。目前，在發酵條件優化過程中，常使用的試驗設計包括單因素、正交試驗、響應面法等[4-6]。但考慮到影響發酵條件之間的交互作用以及優化后的效果常使用響應面法和正交設計。

本課題組從楊凌地區腐爛秸稈和腐殖質土壤樣品中分離出一株耐熱、耐酸堿性強且產酶量較高的纖維素降解菌NP29,經鑒定其屬于枯草芽孢桿菌。該酶反應的最適pH值為4.5，最適反應溫度為65℃,具有良好的pH值穩定性和熱穩定性[7]。本試驗以菌株NP29為研究對象，采用響應面法對主要的液體發酵因素進行優化，以期快速有效地確定該菌株產酶的最佳條件，提高其產酶能力。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種為Bacillus subtilis NP29菌株，由本實驗室分離并保藏。

基礎培養基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物 5.0 g、NaCl 10.0 g、H2O 1 000 ml，pH 值自然。

初始產酶培養基:羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)10 g、可溶性淀粉20 g、稻殼粉5 g、蛋白胨10 g、酵母提取物 10 g、K2HPO41 g、NaH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、FeSO4·7H2O 0.15 g、MnSO40.000 5 g、H2O 1 000 ml，pH值7.0。

1.2 方法

1.2.1 纖維素酶粗酶液的制備

取搖瓶發酵液，4℃、10 000 r/min離心10 min，上清液即為纖維素酶粗酶液。

1.2.2 羧甲基纖維素酶（CMCase）活力測定方法

采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測定CMCase[8]。取經適當稀釋的粗酶液0.1 ml，加入已預熱至65℃的0.5%（w/v，pH值4.5）的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液0.9 ml，在65℃反應5 min后立即加入2 ml DNS，煮沸 5 min，流水冷卻稀釋至 20 ml，540 nm 波長處測吸光值，加熱失活的酶液作為空白對照。將在上述條件下每分鐘由底物生成1 μmol還原糖所需酶量定義為一個酶活力單位，用U/ml表示。

1.2.3 Plackett-Burman試驗

使用Plackett-Burman試驗篩選枯草芽孢桿菌NP29產纖維素酶培養基的重要影響因素。應用Design Expert 8.0軟件對影響菌株NP29產纖維素酶的9個因素進行篩選，每個因素分別確定高（+）和低（-）兩個水平。選擇N=12的設計進行試驗，通過Design Expert 8.0軟件對試驗數據進行分析，獲得多元一次回歸方程：

式中：Y——CMCase的預測值（U/ml）；

X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9分別為發酵過程中的參數；

1.2.4 最陡爬坡試驗

根據Plackett-Burman試驗中找到對CMCase活性影響最大的主要因素后，通過使主要因素同時朝響應值增大的方向變化，找到響應值的最大值，從而逼近最大響應區域。

1.2.5 Box-Behnken試驗

根據最陡爬坡試驗結果，以CMCase酶活性為響應值，以主要發酵因素為自變量，利用Design Expert 8.0軟件進行Box-Behnken試驗設計，試驗數據進行回歸擬和并對擬和方程作顯著性檢驗及方差分析，制作響應面和等值線。

1.2.6 驗證試驗

根據前面試驗所得到的最佳發酵產酶條件進行試驗，將所測定的CMCase活性與響應面預測結果進行比較，以驗證模型的可靠性。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗

利用Plackett-Burman試驗從影響枯草芽孢桿菌NP29菌株產纖維素酶的9個發酵因素中篩選出顯著影響CMCase活性的主要因素。各因素及水平見表1，試驗設計與結果見表2,各因素主效應分析結果見表3。

表1 Plackett-Burman試驗設計各因素水平

表2 Plackett-Burman試驗設計及結果

表3 Plackett-Burman試驗各因素主效應分析結果

通過Design Expert 8.0軟件對試驗數據進行分析，得到多元一次回歸方程：

該回歸模型P=0.035 1＜0.05，說明該模型顯著。各發酵因素對Bacillus subtilis NP29產耐熱性纖維素酶的影響顯著性順序為：溫度＞可溶性淀粉＞接種比例＞胰蛋白胨＞起始pH值＞稻殼粉＞酵母提取物＞裝瓶量＞羧甲基纖維素鈉。其中，溫度與可溶性淀粉顯著影響CMCase活性（P＜0.05），接種比例對響應值的影響雖不顯著（P=0.051 2），但仍具有較大影響，也予以考慮。因此，要提高該菌株產酶量，應該提高淀粉含量和培養溫度，降低接種比例。

2.2 最陡爬坡試驗

響應面擬合出的方程只有在臨近最佳值的區域內才能充分接近真實情形,因此,必須逼近最佳值區域后才能建立有效的響應面擬合方程[9]。根據Plackett-Burman試驗中各發酵因素對CMCase大小的正、負效應確定其余因素的水平分別為:羧甲基纖維素鈉20 g/l、稻殼粉 5 g/l、胰蛋白胨 15 g/l、酵母提取物 15 g/l、pH值8.0、裝瓶量80 ml/250 ml。對淀粉含量、培養溫度和接種比例進行最陡爬坡試驗,試驗設計與結果見表4。從結果可以看出，試驗4可達最大CMCase活性，因此以該試驗的條件作為Box-Behnken試驗的中心點。

表4 最陡爬坡試驗設計及結果

2.3 Box-Behnken試驗

采用Box-Behnken試驗進行3因素3水平的中心組合試驗，試驗包括12個析因試驗和3個中心試驗，試驗設計及結果見表5。

表5 Box-Behnken試驗設計及結果

利用Design Expert 8.0軟件對表5結果進行處理，確定回歸方程為：

該回歸方程的方差分析見表6，其中模型P=0.008 8＜0.05，失擬項 P=0.120 0＞0.05，說明該模型回歸顯著而失擬不顯著。另外，該方程回歸系數R2=0.950 8，說明該方程的擬合程度較好，預測值和實際值之間具有高度的相關性，可以應用于枯草芽孢桿菌NP29菌株產纖維素酶的理論預測。同時得出當淀粉含量、培養溫度、接種比例分別為21.44 g/l、41.07℃、1.88%時，理論最大CMCase活性為4.263 U/ml。

表6 二次多項模型方差分析

利用Design Expert 8.0軟件繪制的響應面圖及等值線圖見圖1。由響應面圖可以看出淀粉含量、培養溫度、接種比例之間存在交互作用，在試驗水平內，隨淀粉含量、培養溫度、接種比例的升高，CMCase活性呈先升高后降低的趨勢。

2.4 驗證試驗

根據試驗得出菌株NP29產纖維素酶的最佳發酵條件是：羧甲基纖維素鈉20 g/l、稻殼粉5 g/l、胰蛋白胨15 g/l、酵母提取物15 g/l、pH值8.0、裝瓶量80 ml/250 ml、淀粉21.44 g/l、接種比例1.88%、培養溫度41.07℃。在此條件下培養36 h后測定CMCase活性，3個平行試驗的結果分別為 4.258、4.302、4.273 U/ml，平均值為4.278 U/ml，與理論預測值僅相差0.35%，可見該模型能夠很好地預測菌株NP29的產酶條件。

圖1 響應面法三維曲面圖和等高線

將種子培養基按1.0%接種于初始產酶培養基中37℃培養36 h后測定CMCase活性為2.021 U/ml，因此，利用響應面法獲得的最佳產酶條件可使CMCase活性提高111.68%。

3 結論與討論

纖維素酶在飼料、食品、紡織、釀造、化工等諸多領域被廣泛應用，對解決能源危機、食物短缺、環境污染等具有重大的現實意義[10-11]。隨著纖維素酶用量的不斷增加，纖維素酶生產呈現良好的上升勢頭。但目前發酵工業中發酵成本過高嚴重制約著纖維素酶的進一步應用。為了提高纖維素酶的產量，越來越多的國內外學者開始將研究重點轉向纖維素酶的發酵生產，使得發酵技術不斷提高，發酵工藝不斷改善。

響應面法是用來對受多個變量影響的響應值進行優化的一種回歸分析方法,具有試驗次數少、周期短，求得的回歸方程精確度高,又能研究幾個因素間交互作用[12]等優點。目前,利用該方法對不同微生物的發酵條件進行優化,均不同程度地提高目標產物的產量。張歡等[13]采用響應面法優化HA-A38菌株的發酵培養基,結果顯示菌體濃度增加了近1倍。唐志紅等[14]利用該方法優化YDX-1菌株的發酵條件,纖維素酶活性提高了81.97%。顧芮萌等[15]使用響應面法優化粗糙脈孢菌的液體培養基,使FPA活性提高了2.03倍,CMCase活性提高了1.88倍,木聚糖酶活性提高了1.86倍,葡萄糖苷酶活性提高了2.08倍。這表明，響應面法是一種科學、合理的優化響應值的方法。

本研究利用響應面法優化枯草芽孢桿菌NP29菌株產纖維素酶培養條件,用以提高該菌株的產酶量。研究結果表明,淀粉含量、培養溫度和接種比例是影響該菌株纖維素酶產量的最重要的三個因素。而通過最陡爬坡法和響應面優化試驗得到了最佳的發酵條件,即羧甲基纖維素鈉 20 g/l、稻殼粉5 g/l、胰蛋白胨15 g/l、酵母提取物 15 g/l、pH 值 8.0、裝瓶量 80 ml/250 ml、淀粉含量21.44 g/l、接種比例1.88%、培養溫度41.07℃。在此條件下獲得的纖維素酶活性較優化前提高了111.68%。