蒸發(fā)光散射-HPLC法測定硫酸妥布霉素注射液中的有關(guān)物質(zhì)

朱曉璐，林昀，李霞（1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶400044；.重慶市藥品檢驗(yàn)所，重慶40111）

妥布霉素屬氨基糖苷類抗菌藥物，在紫外波段上只有末端吸收，2005年版《中國藥典》[1]未對硫酸妥布霉素注射液中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行控制；《美國藥典（USP）》31版[2]上采用薄層色譜（TLC）方法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)控制，該方法經(jīng)筆者進(jìn)行一系列方法學(xué)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)不能有效控制妥布霉素中的有關(guān)物質(zhì)，而《英國藥典（BP）》2008版[3]、《歐洲藥典》6.0版[4]上均采用的電化學(xué)檢測-高效液相色譜（HPLC）法，由于儀器昂貴，普及有一定難度。故筆者參考有關(guān)資料，采用蒸發(fā)光散射-HPLC法對硫酸妥布霉素注射液中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了探索性考察。

1 儀器與試藥

LC-2010 A型HPLC儀（日本島津公司）；ELSD2000型蒸發(fā)光散射檢測器（美國Alltech科技公司）；Phenomenex Syregy C18色譜柱（250 mm×4.60 mm，5μm）、Phenomenex Gemini-NX C18色譜柱（250 mm×4.60 mm，5μm）、Phenomenex Luna C18色譜柱（250 mm×4.60 mm，5μm）。

三氟乙酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純，批號(hào)：F20071220）；妥布霉素對照品（批號(hào)：130527-200402，含量：91.4%）、卡那霉素B對照品（批號(hào)：130548-200501）、新霉胺對照品（批號(hào)：130411-200307）均來自中國食品藥品檢定研究院；暗霉胺由天津市藥檢所提供；硫酸妥布霉素注射液89批，分別來源于湖北天藥藥業(yè)股份有限公司等14家企業(yè)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18柱；流動(dòng)相：0.2 mol·L－1三氟乙酸溶液；流速：0.4 mL·min－1；蒸發(fā)光散射檢測器；飄移管溫度：110℃；載氣流量：3.0 L·min－1。

2.2 雜質(zhì)定位及輔料干擾考察

取妥布霉素已知雜質(zhì)新霉胺、卡那霉素B、暗霉胺適量，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行雜質(zhì)定位測定。結(jié)果，各雜質(zhì)之間以及雜質(zhì)與妥布霉素均能有效分離。另，由于硫酸妥布霉素注射液的處方相對單一，只有亞硫酸氫鈉（或亞硫酸鈉）、依地酸二鈉和硫酸，故筆者對這幾種輔料的干擾均進(jìn)行了檢測。各雜質(zhì)及輔料出峰典型圖譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.3 強(qiáng)制性破壞分離度考察試驗(yàn)

取樣品適量，分別進(jìn)行強(qiáng)制性熱破壞（60℃下放置10 d，121℃下放置30 min）、光破壞（裸置于紫外光下48 h）以及氧化破壞（樣品1 mL，加入30%雙氧水1 mL，水1 mL，反應(yīng)2 h后加水稀釋至10 mL，供檢測用），按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，妥布霉素與降解雜質(zhì)能有效分離。

2.4 線性關(guān)系考察

取妥布霉素對照品0.01580 g，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，作對照液5。再取上述溶液分別加水稀釋制成14.44、28.88、46.21、101.09 μg·mL－1系列濃度的對照液1～4，將對照液1～5分別進(jìn)樣，記錄峰面積。以相應(yīng)的峰面積的常用對數(shù)值與對照液濃度的常用對數(shù)值分別作為橫縱坐標(biāo)，以最小二乘法計(jì)算回歸方程得：lgA=1.2156 lgC+3.139（r＝0.9954，n＝5）。結(jié)果表明，妥布霉素檢測濃度在0.14～1.01 μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 檢出限考察

以妥布霉素計(jì)，本方法檢測限為0.1072μg，定量限為0.2528μg，最小檢出濃度為5.80μg·mL－1，最小檢出限為0.14%。

2.6 對照溶液的選擇

曾有研究資料[5]顯示，不同pH的妥布霉素供試品溶液采用HPLC分析方法，用蒸發(fā)光散射檢測器檢測時(shí)，其響應(yīng)值有較大差異，如：取硫酸妥布霉素，加水溶解并稀釋制成每1 mL中含40μg妥布霉素的供試品溶液，其pH為5.08；而取妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)品，制成相同濃度溶液時(shí)，其pH為8.70，進(jìn)樣后前者峰面積響應(yīng)值為后者的2倍，為保證結(jié)果的正確性，其采用了供試品溶液稀釋的自身對照法。為此，筆者也對pH的變化對響應(yīng)值的影響進(jìn)行了考察，結(jié)果見表1。

表1 pH值對妥布霉素響應(yīng)值的影響Tab 1 Effects of pH value on tobramycin response value

上述結(jié)果表明，用蒸發(fā)光散射檢測器檢測時(shí)，當(dāng)妥布霉素對照品與硫酸妥布霉素注射液樣品均稀釋制成相同濃度時(shí)，盡管兩者pH相差較大，但峰的響應(yīng)值并沒有太大差異。結(jié)果表明，用蒸發(fā)光散射檢測器檢測時(shí)，供試品溶液pH對測定結(jié)果并無明顯影響，故筆者選用了對照品對照法。

2.7 不同型號(hào)色譜柱對妥布霉素與卡那霉素B分離度影響的考察試驗(yàn)

根據(jù)各雜質(zhì)以及輔料定位情況，卡那霉素B與妥布霉素相鄰，為考察色譜柱填料對其分離度的影響，筆者采用不同填料的C18柱對妥布霉素與卡那霉素B的分離度進(jìn)行了考察，結(jié)果見圖2～圖4。

結(jié)果顯示，該色譜系統(tǒng)對柱子的選擇性較大，同一品牌的C18柱由于其填料的細(xì)微差別，可引起其保留時(shí)間較大的變化，以致影響妥布霉素與卡那霉素B之間的分離度。

圖2 Syregy C18Fig 2 Syregy C18

圖3 Gemini-NX C18Fig 3 Gemini-NX C18

圖4 Luna C18Fig 4 Luna C18

3 討論

在該色譜條件下，硫酸根和亞硫酸根均在相對保留時(shí)間約0.46 min的位置出峰，鈉離子在相對保留時(shí)間約0.52 min的位置出峰，依地酸根在主峰前位置出峰，與卡那霉素B雜質(zhì)出峰位置重合，出峰時(shí)間相對保留時(shí)間約0.94 min，但依地酸二鈉在按處方比例加入后稀釋到測定溶液濃度（4 mg·mL－1）時(shí)，已檢測不出乙二胺四乙酸（EDTA）主峰，故對雜質(zhì)測定無影響。

強(qiáng)制性破壞試驗(yàn)結(jié)果顯示，妥布霉素對熱穩(wěn)定性較好，其能夠耐受115℃、30 min的滅菌溫度，但121℃、30 min的過度滅菌方式雜質(zhì)個(gè)數(shù)和雜質(zhì)總量均明顯增加，對暗霉胺影響不明顯，但長時(shí)間的干熱（60℃，10 d）會(huì)引起暗霉胺的增加；其對光敏感性不強(qiáng)，但易氧化。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：270.

[2]The United States Pharmacopoeia Convention.U.S.Pharmacopoeia/National Formulary[S].31.

[3]British Pharmacopoeia Commission.British Pharmacopoeia[S].2008.

[4]European Directorate for Quality Medicines.European Pharmacopoeia[S].6.0.

[5]天津市食品藥品檢驗(yàn)所.《中國藥典》2010年版草案[Z].2010.