HPLC法測定紫果西番蓮葉中白楊素的含量Δ

趙瑞瑞，鄒江冰，孔秋玲，蔣琳蘭（廣州軍區廣州總醫院藥劑科，廣州510010）

紫果西番蓮Passiflora edulis Sims是西番蓮科西番蓮屬植物，是我國栽種面積最廣泛的品種之一，目前在我國臺灣、福建、廣東、廣西和云南等地均有栽培[1]。其果實因具有怡人的香味與豐富的營養而深受人們喜愛。在北美及歐洲，多種西番蓮葉提取物已作藥用，具有抗氧化、抗焦慮、鎮靜、抗菌消炎、利尿、滋補等作用[2]，在治療酒精、尼古丁、嗎啡以及大麻酚的藥物成癮性上也有很好的療效[3]。西番蓮葉提取物在一些國家已被批準臨床應用，并被正式列入了美國藥典、英國藥典、巴西藥典、瑞典藥典以及其他一些國家的藥典[4]。

1 儀器與試藥

515 HPLC系統，含1525二元高壓梯度泵、717自動進樣器、2487雙吸光度檢測器、Breeze工作站（美國Waters公司）；JA1003電子分析天平（上海精科天平儀器廠）；TP-320A電子天平（湘儀天平儀器設備有限公司）；UV-POWER紫外-可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司）。

柱色譜硅膠、硅膠G板（青島海洋化工廠）；白楊素標準品（上海同田生物科技有限公司，純度＞98%）；流動相所用乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。紫果西番蓮葉購于廣東梅州市五華縣百香果園（批號：20091201），經廣東藥學院中藥學院田素英教授鑒定為真品，風干粉碎過80目篩后貯藏于廣州軍區廣州總醫院藥劑科實驗室。

2 方法與結果

2.1 檢測波長的選擇

應用紫外-可見分光光度計在190～400 nm波長范圍內對白楊素標準品進行最佳吸收波長掃描，發現其在220、267、315 nm波長處有較好吸收，且在220 nm波長處具有最佳吸收，故本試驗選定檢測波長為220 nm。

2.2 色譜條件

色譜柱：依利特Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸（18∶82）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：220 nm。

2.3 溶液的制備

2.3.1 標準品貯備液 精密稱取白楊素標準品3.000 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為白楊素標準品貯備液。

2.3.2 供試品溶液 稱取紫果西番蓮葉粉末234.0 g，用60%乙醇（料液比1∶30）于60℃加熱回流提取2次，每次2 h，減壓回收溶劑得浸膏，用水分散后依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等溶劑采用索式萃取器提取。正丁醇（15.0 g）部分經硅膠柱色譜分離、乙酸乙酯-丙酮梯度洗脫，得Fr.2組分4.0 g。再以乙酸乙酯-正丁醇-甲醇（2∶2∶1）為洗脫劑對Fr.2進行硅膠柱純化，得供試品。取標準品與供試品的甲醇溶液，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-丁酮（9.4∶0.3∶0.3）為展開劑，展開，取出，晾干，置碘缸中檢視，兩者在相應位置出現相同顏色斑點[9]，故初步確認供試品為白楊素。精密稱取供試品5.000 mg，加甲醇溶解并定容至3 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過后進行HPLC分析。色譜見圖1。

2.4 線性關系考察

精密量取白楊素標準品溶液0.5、1、2、4、5 mL，置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成每1 mL分別含0.012、0.024、0.048、0.096、0.120 mg白楊素的系列濃度溶液，各進樣10μL，按上述色譜條件測定峰面積。以白楊素濃度（X，mg·mL－1）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，制備標準曲線，得回歸方程為Y＝986863X+1305.7（r＝0.9980，n＝5）。結果表明，白楊素的檢測濃度在0.012～0.120 mg·mL－1范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.5 精密度試驗

取白楊素標準品溶液適量，重復進樣5次，記錄峰面積。結果，RSD＝1.12%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液適量，分別于制備后0、4、8、12、24 h進樣，記錄峰面積。結果，RSD＝1.01%（n＝5），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一批供試品5.000 mg，共6份，分別按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，記錄峰面積，計算白楊素的平均含量。結果，RSD＝1.78%（n＝5），表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知白楊素含量的紫果西番蓮葉提取物適量，共6份，分別精密加入白楊素標準品溶液適量，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣10 μL，依法測定，計算加樣回收率，結果見表1。

2.9 樣品含量測定

取3個批次的紫果西番蓮葉樣品適量，分別按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分離、測定，以外標法計算樣品含量。結果，3批樣品中白楊素含量分別為0.0485%、0.0479%、0.0489%，平均含量為0.0484%，RSD＝1.04%（n＝3）。

3 討論

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Result of recovery tests（n＝6）

目前，從西番蓮屬植物中分離得到的黃酮類化合物已有20余種，但是從紫果西番蓮葉中分離得到的黃酮類化合物卻很少。由于紫果西番蓮葉中黃酮類化合物含量低等原因，對其分離、純化比較困難，應用HPLC法測定紫果西番蓮葉中單體化合物的含量就成為一種較可行的方式。本試驗首先采用硅膠柱色譜分離法對紫果西番蓮葉的粗提物進行活性成分富集，然后采用薄層色譜法對其中的白楊素進行鑒定，并用HPLC法對其含量進行測定，方法準確、可靠、重復性好，可為紫果西番蓮葉中化學成分的分析測定提供新的方法和參考，并可廣泛用于西番蓮屬植物中白楊素含量的測定。

[1]周玉娟，談 鋒，鄧 君.西番蓮屬植物的研究進展[J].中國中藥雜志，2008，33（15）：1789.

[2]鄒江冰，袁 進.2種西番蓮葉中黃酮的抗氧化活性研究[J].中國藥房，2010，21（35）：3280.

[3]Kamaldeep Dhawan，Suresh Kumar，Anupam Sharma.Suppression of alcohol-cessation-oriented hyper-anxiety by the benzoflavone moiety of Passiflora incarnata Linneaus in mice[J].J Ethnopharmacol，2002，81（2）：239.

[4]Kamaldeep Dhawan，Suresh Kumar，Anupam Sharma.Anti-anxiety studies on extracts of Passiflora incarnata Linneaus[J].J Ethnopharmacol，2001，78（2-3）：165.

[5]Salguero B，Ardenghi P，Dias M，et al.Anxiolytic natural and synthetic flavonoid ligands of the central benzodiazepine receptor have no effect on memory tasks in rats[J].Pharmacol Biochem Behav，1997，58（4）：887.

[6]Wolfman C，Viola H，Paladini A，et al.Possible anxiolytic effects of chrysin，a central benzodiazepine receptor ligand isolated from Passiflora caerulea[J].Pharmacol Biochem Behav，1994，47（1）：1.

[7]Brown E，Hurd NS，McCall S，et al.Evaluation of the anxiolytic effects of chrysin：a Passiflora incarnata extract，in the laboratory rat[J].AANA J，2007，75（5）：333.

[8]Sena LM，Zucolotto SM，Reginatto FH，et al.Neuropharmacological activity of the pericarp of Passiflora edulis flavicarpa degener：putative involvement of C-glycosylflavonoids[J].Exp Biol Med（Maywood），2009，234（8）：967.

[9]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：336.