川芎嗪聯合丹參酮ⅡA對缺血再灌注大鼠肺損傷的保護作用研究

韓敏珍，冉群釵（貴陽醫學院第二附屬醫院，貴陽 556000）

體外循環心臟外科手術、肺移植、心肺聯合移植手術在臨床上已成為常規手術，但肺缺血再灌注損傷是術后最常見的并發癥和導致死亡（流行病學調查顯示其病死率達35%～40%）的主要原因之一[1～3]。川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）原名芎藭，民間常用其治療跌撲腫痛、頭痛等證。其性味辛、溫、香、燥，乃血中之氣藥，具有辛散、解郁、通達、止痛等功效。丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）又名赤參、紫丹參、紅根等，民間常用其治療月經不調、熱痹疼痛，心煩不眠、心絞痛等證。其性味苦、微寒，具有活血調經、祛瘀止痛、涼血消癰、清心除煩、養血安神等功效[4]。目前對于川芎和丹參聯合治療肺缺血再灌注損傷方面的研究少有報道。為此，筆者將川芎有效成分川芎嗪與丹參有效成分丹參酮ⅡA對肺缺血再灌注損傷模型大鼠的保護作用進行研究，以期為肺缺血再灌注損傷的臨床用藥提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BH-1200型電子天平（上海英展機電企業有限公司）；DZF型真空干燥箱（上海華連醫療器械有限公司）；UV3200型紫外分光光度計（上海美普達儀器有限公司）；MX51型顯微鏡（日本Olympus公司）；AJ5805型微量注射泵（上海安潔電子設備有限公司）；1-14K型高速離心機（德國Sigma公司）。

1.2 試藥

鹽酸川芎嗪（珠海遠程醫藥化工有限公司，批號：20110317，含量：＞99%）；丹參酮ⅡA（武漢大華偉業醫藥化工有限公司，批號：20110109，含量：90%）；醋酸地塞米松（DEX，上海撫生實業有限公司，批號：20101105）；維庫溴銨（上海工碩生物技術有限公司）；丙二醛（MDA）、髓過氧化物酶（MPO）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 動物

清潔級SD大鼠70只，♀♂兼用，體重（220±20）g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供（動物使用合格證號：SCXK（渝）2002001）。

2 方法

2.1 模型的制備

參考Eppinger方法[5]，以維庫溴銨0.6 mg·kg－1·h－1經微量注射泵持續輸注維持麻醉。大鼠右側臥位，經左側第五肋間進胸，離斷左下肺韌帶，游離左肺門，靜脈注射50 u肝素5 min后，用無創血管夾夾閉左肺門（包括左主支氣管與左肺動、靜脈），少量冰鹽水沖洗肺表面，縫線閉合胸腔。阻斷45 min后松開血管夾，形成再灌注。假手術組的大鼠僅做游離左肺門，并不進行夾閉。

2.2 分組與給藥

70只大鼠均分為7組，即空白對照（等容生理鹽水）、假手術（等容生理鹽水）、模型（等容生理鹽水）、DEX（5 mg·kg－1）和川芎嗪+丹參酮ⅡA高、中、低劑量（40+12、20+6、10+3 mg·kg－1）組。ig相應藥物，每天1次，于缺血前3 d進行，連續3 d。

2.3 指標的檢測

2.3.1 MDA含量、MPO活性的檢測 于再灌注24 h后，動脈放血處死大鼠，取大鼠血漿按試劑盒說明書檢測MDA含量；留取部分左肺下葉組織凍存，按試劑盒說明書檢測肺組織MPO含量。

2.3.2 濕重/干重比值（W/D）的檢測 取肺吸干表面水分后稱重，為濕重（W）；再置于80℃真空干燥箱干燥48 h至恒重后稱重，為干重（D）。計算W/D。

2.3.3 肺通透指數的檢測 于再灌注24 h后，局麻狀態下將纖維支氣管鏡插入左肺舌段的支氣管，將其端口插入支氣管分支開口，注入37℃的無菌生理鹽水，每次30～50 mL，總量200 mL，以－15 kpa負壓吸出，收集于容器。取大鼠全血，于4 ℃、3000 r·min－1離心10 min，取上清液。采用考馬斯亮藍染色法（Bradford法）測定血清總蛋白含量和支氣管灌洗液（BALF）蛋白含量，按下列公式計算肺通透指數：肺通透指數（%）＝BALF蛋白含量/血清蛋白含量×100%。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 MDA含量、MPO活性的測定結果

缺血再灌注24 h后，與空白對照組比較，模型組MDA含量顯著增加（P＜0.01），MPO活性顯著增強（P＜0.01）。與模型組比較，川芎嗪+丹參酮ⅡA高、中劑量組MDA含量顯著減少（P＜0.01或P＜0.05），MPO活性顯著減弱（P＜0.01或P＜0.05）；川芎嗪+丹參酮ⅡA低劑量組MDA含量有所減少，MPO活性有所減弱，但無顯著性差異（P＞0.05）。MDA含量、MPO活性的測定結果見表1。

3.2 W/D、肺通透指數的測定結果

缺血再灌注24 h后，與空白對照組比較，模型組W/D、肺通透指數顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，川芎嗪+丹參酮ⅡA高、中劑量組W/D、肺通透指數顯著減少（P＜0.01或P＜0.05）；川芎嗪+丹參酮ⅡA低劑量組W/D、肺通透指數有所減少，但無顯著性差異（P＞0.05）。W/D、肺通透指數的測定結果見表2。

表1 MDA含量、MPO活性的測定結果（±s，n＝10）Tab 1 Determination of MDA content and MPO activity（±s，n＝10）

表1 MDA含量、MPO活性的測定結果（±s，n＝10）Tab 1 Determination of MDA content and MPO activity（±s，n＝10）

與空白對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對照組假手術組模型組DEX組川芎嗪+丹參酮ⅡA高劑量組川芎嗪+丹參酮ⅡA中劑量組川芎嗪+丹參酮ⅡA低劑量組劑量/mg·kg－1---540±1220±610±3 MDA/mmol·mg－16.89±0.376.72±0.269.31±0.30＊7.06±0.29##7.34±0.31##7.92±0.24#8.87±0.35 MPO/IU·g－11.13±0.091.19±0.071.64±0.12＊1.20±0.08##1.29±0.12##1.38±0.14#1.46±0.11

表2 W/D、肺通透指數的測定結果（±s，n＝10）Tab 2 Determination of W/D and lung permeability index（±s，n＝10）

表2 W/D、肺通透指數的測定結果（±s，n＝10）Tab 2 Determination of W/D and lung permeability index（±s，n＝10）

與空白對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對照組假手術組模型組DEX組川芎嗪+丹參酮ⅡA高劑量組川芎嗪+丹參酮ⅡA中劑量組川芎嗪+丹參酮ⅡA低劑量組- - - 540±1220±610±34.15±0.164.17±0.145.73±0.09＊4.24±0.11##4.45±0.08##4.87±0.13#5.19±0.110.69±0.110.74±0.092.84±0.09＊0.85±0.12##1.24±0.17##1.89±0.14#2.42±0.08劑量/mg·kg－1W/D肺通透指數

4 討論

肺缺血再灌注后機體供氧突然增加，產生大量過氧化產物，中性粒細胞（PMN）大量生成，激活與釋放多種炎性介質，引起微血管損傷[6]。MDA是脂質過氧化過程中形成的代謝產物，其含量高低不僅反映了體內氧化程度，并且被視為判斷氧自由基產生和組織損傷的主要標志之一[7]。PMN中存在MPO，每個細胞所含該酶的量約為細胞干重的5%，通過分析該酶活性可間接測定PMN的數量，反映PMN的異常情況，也間接反映組織損傷水平。有報道[8]，肺經缺血再灌注后，PMN的激活與黏附可引起微血管通透性增高，細胞間質水腫，肺含水量增多，是患者呼吸功能下降的原因之一。W/D表示組織水腫形成情況，間接反映毛細血管的通透性。肺通透指數能更加直觀地反映肺的通透性。

本研究表明，模型組較空白對照組大鼠血漿MDA含量顯著增加（P＜0.01），肺勻漿MPO活性顯著增強（P＜0.01），W/D、肺通透指數顯著增加（P＜0.01），表明肺缺血再灌注模型大鼠復制成功。川芎嗪+丹參酮ⅡA高、中劑量組較模型組大鼠血漿MDA含量顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），肺勻漿MPO活性顯著減弱（P＜0.05或P＜0.01），W/D、肺通透指數顯著減小（P＜0.05或P＜0.01）；川芎嗪+丹參酮ⅡA低劑量組各項指標有改善趨勢但無顯著性差異，表明川芎嗪+丹參酮ⅡA聯合用藥對肺缺血再灌注損傷大鼠有保護作用。

綜上所述，川芎嗪+丹參酮ⅡA聯合用藥可減少過氧化物MDA的生成，減弱MPO活力，從而起到減少PMN數量的作用，并能降低W/D和肺通透指數以增加肺與毛細血管的通透性，從而在臨床對肺缺血再灌注損傷的用藥方面提供實驗支持。

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