褐藻多糖硫酸酯精提物對慢性腎衰模型大鼠的保護作用研究Δ

李娟，何海霞，周遠大#，郝守祝（.重慶醫科大學附屬第一醫院藥學部，重慶40006；.北京世紀博康醫藥科技有限公司，北京 00070）

慢性腎衰竭（Chronic renal failure，CRF）是各種原因導致腎臟慢性進行性損害，使其不能維持基本功能，臨床以代謝產物和毒素的潴留，水、電解質和酸堿平衡紊亂以及某些內分泌功能異常等表現為特征的一組綜合征。目前，晚期慢性CRF患者只能依賴腎臟替代療法（透析、腎移植）來延長生命。在CRF治療過程中，尤其是對早、中期CRF，中醫藥（特別是利用海帶、昆布等海洋藥物）有著自身的特殊優勢和豐富的臨床經驗。據文獻報道[1～3]，褐藻多糖硫酸酯（Fucoidan sulfate，FS）具有改善腎功能、延緩病情進展的功效。但目前臨床上應用的FS僅是粗提物，由巖藻糖、半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖等單糖和硫酸基組成，總有效成分含量僅50%左右；其精提物（Refined fucoidan sulfate extraction，RFSE）為高純度的單一組分，由巖藻糖、半乳糖和硫酸基組成，總有效成分含量可達90%以上[4]。本研究通過復制腺嘌呤所致大鼠CRF模型，探究RFSE對CRF的療效，為臨床用藥提供理論參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ALCYON300型全自動生化測定儀（美國雅培公司）；MEK-6108K型血液分析儀（日本光電公司）。

1.2 試藥

腺嘌呤（新鄉拓新化工廠，批號：060504）；醋酸地塞米松片（天津天藥藥業股份有限公司，批號：20050545）；RFSE、FS（北京世紀博康醫藥有限公司）；尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、總蛋白、白蛋白、考馬斯亮藍試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 動物

清潔級SD大鼠88只，♂，體重180～240 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供（動物使用合格證號：SCXK（渝）20070001）。

2 方法與結果

2.1 統計學方法

2.2 模型的復制與分組、給藥

取SD大鼠88只，隨機抽取10只作為正常對照，其余大鼠ig 365 mg·kg－1腺嘌呤復制CRF模型，每天1次，連續20 d。于復制模型結束后，根據血清Scr和BUN的含量，選取復制模型成功的大鼠60只，參考文獻[5]隨機分成6組，即模型（1%羧甲基纖維素鈉）、地塞米松（0.1 mg·kg－1）、FS（100 mg·kg－1）和RFSE高、中、低劑量（100、50、25 mg·kg－1）組。ig給藥，給藥容量為1 mL·100 g－1，每天2次，連續25 d。

2.3 RFSE對模型大鼠一般狀況、24 h尿量和尿蛋白的影響

觀察大鼠的精神狀態、活動狀況、體重、體毛、大小便、攝食和飲水狀況。于末次給藥后，將大鼠分別置于代謝籠中收集24 h尿量，并以考馬斯亮藍法檢測尿蛋白。

結果，正常對照組大鼠體毛呈白色、有光澤、順滑，無脫毛現象，飲食正常，反應靈敏。模型組大鼠毛色日漸變灰、無光澤、不順滑，脫毛現象嚴重，精神萎靡，活動緩慢且減少，飲食、尿量減少，體重進行性下降。各用藥組較模型組上述情況有不同程度的改善，其中以RFSE高劑量組的一般狀況最好。

與正常對照組比較，模型組24 h尿量、24 h尿蛋白均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，RFSE高、中、低劑量組24 h尿量均顯著降低（P＜0.05），高劑量RFSE作用尤為顯著；RFSE高、中、低劑量組24 h尿蛋白均顯著減少（P＜0.01）。與FS組比較，RFSE高劑量組24 h尿蛋白顯著減少（P＜0.01）。各組大鼠24 h尿量和尿蛋白比較見表1。

表1 各組大鼠24 h尿量和尿蛋白比較（±s，n＝10）Tab 1 Comparison of urine volume and protein in 24 hours among those groups（±s，n＝10）

表1 各組大鼠24 h尿量和尿蛋白比較（±s，n＝10）Tab 1 Comparison of urine volume and protein in 24 hours among those groups（±s，n＝10）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與FS組比較：△P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01；vs.FS group：△P＜0.01

組別正常對照組模型組地塞米松組FS組RFSE高劑量組RFSE中劑量組RFSE低劑量組24 h尿量/mL 11.10±6.9725.40±15.51＊15.20±8.46#20.10±12.5611.12±14.10#16.10±14.81#17.97±7.53#24 h尿蛋白/mg 5.6±1.4735.13±6.93＊18.03±6.71##12.97±5.12##7.57±2.82##△15.98±6.50##18.73±5.61##

2.4 RFSE對模型大鼠血常規和血液生化指標的影響

大鼠末次給藥后禁食24 h，取血5～6 mL，抗凝血測定紅細胞數（RBC）、血紅蛋白（Hb），并測血清Ca2+、P3+、BUN和Scr含量。

與正常對照組比較，模型組RBC和Hb的含量顯著減少（P＜0.05）；Scr、BUN和P3+的含量顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，RFSE高、中、低劑量組RBC和Hb的含量略有增加，但無顯著性差異（P＞0.05）；Scr、BUN和P3+的含量顯著減少（P＜0.01或P＜0.05）。與FS組比較，RFS高、中、低劑量組RBC、Hb、Scr、BUN、Ca2+、P3+無顯著性差異（P＜0.05）。各組大鼠血液學指標比較見表2；各組大鼠血液生化指標比較見表3。

表2 各組大鼠血液學指標比較（±s，n＝10）Tab 2 Comparison of hematology index in rats among those groups（±s，n＝10）

表2 各組大鼠血液學指標比較（±s，n＝10）Tab 2 Comparison of hematology index in rats among those groups（±s，n＝10）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.01

組別正常對照組模型組地塞米松組FS組RFSE高劑量組RFSE中劑量組RFSE低劑量組RBC/1012·L－16.53±0.334.92±0.55＊6.64±0.54#5.79±0.41#5.10±0.235.23±0.365.15±0.40 Hb/g·L－1126.20±5.53100.50±9.61＊133.40±7.52#116.60±4.95#104.50±4.14107.20±5.77104.40±6.35

表3 各組大鼠血液生化指標比較（±s，n＝10）Tab 3 Comparison of biochemical indicator in rats among those groups（±s，n＝10）

表3 各組大鼠血液生化指標比較（±s，n＝10）Tab 3 Comparison of biochemical indicator in rats among those groups（±s，n＝10）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組模型組地塞米松組FS組RFSE高劑量組RFSE中劑量組RFSE低劑量組Scr/μmol·L－1115.10±6.89231.78±59.25＊127.20±13.62##122.42±14.93##122.43±7.99##125.92±24.03##126.35±16.75##BUN/mmol·L－15.52±1.4123.92±9.34＊12.19±2.99##13.00±2.48##12.02±2.67##13.64±4.48#14.54±5.20#Ca2+/mmol·L－12.35±0.122.24±0.392.45±0.152.31±0.182.12±0.142.13±0.182.14±0.21 P3+/mmol·L－12.49±0.154.48±1.04＊2.62±0.15##2.77±0.30##2.82±0.28##2.93±0.21##2.72±0.22##

2.5 RFSE對模型大鼠腎臟組織病理形態學的影響

麻醉處死大鼠，取腎組織行病理形態學觀察。參考文獻[6]，并結合觀察情況，對腎小球、腎小管-間質病變進行半定量分級。“－”級：腎小球、腎小管、間質正常；“+”級：變性腎小球數目小于腎小球總數的1/3，腎小管壞死面積小于皮質面積的1/3，間質輕度水腫伴纖維組織增生；“++”級：變性腎小球數目占腎小球總數的1/3～2/3，腎小管壞死面積占皮質面積的1/3～2/3，間質中度水腫伴纖維組織增生；“+++”級：變性腎小球數目超過腎小球總數的2/3，腎小管壞死面積超過皮質面積的2/3，間質重度水腫伴纖維組織增生。

與正常對照組比較，模型組大鼠腎臟組織病理改變顯著。與模型組比較，RFSE高、中劑量組腎小管-間質分級情況顯著降低（P＜0.01）。與FS組比較，RFSE高、中劑量組病理情況顯著改善（P＜0.01）。大鼠腎臟組織病理改變比較見表4；腎臟病理切片見圖1。

3 討論

研究表明[7]，通過腺嘌呤復制的CRF模型與人類CRF所表現出來的代謝紊亂十分接近。因此，本研究應用此模型來研究RFSE對CRF的保護作用。血清Scr、BUN作為CRF診斷及嚴重程度分級的主要指標，又與患者多種臨床癥狀如惡心、嘔吐、心悸、胸悶、皮膚瘙癢與各種出血的發生率呈正相關，故降低血中這些毒素成為緩解腎功能衰竭的重要任務[8]。蛋白尿是預示腎病進展與預后的重要標志之一，其對腎小球上皮細胞與近曲小管細胞等都有損傷作用；且大量蛋白尿超過腎小管重吸收能力，在腎小管內形成管形尿，加重上皮細胞損害與間質炎癥，故控制尿蛋白對CRF患者有重要意義。CRF在表現上除了腎臟功能有一定的改變，還存在不同程度的貧血，因為促紅細胞生成素90%在腎臟分泌，腎功能減退必然會引起促紅細胞生成素的分泌減少而導致貧血[9]，故檢測RBC和Hb是作為急慢性腎衰鑒別診斷的重要依據[10]。另外，由于CRF還存在電解質紊亂以及不同程度的腎臟病理改變，故也應進行相應考察。

表4 大鼠腎臟組織病理改變比較Tab 4 Comparison of pathological changes of renal tissue in rats

圖1 腎臟病理切片圖（HE，100×）Fig 1 Pathological photograph of kidney（HE，100×）

RFSE是從海洋中藥海帶中制備獲得的一種由巖藻糖、半乳糖和硫酸基組成的新結構高純度的低分子硫酸多糖類藥物。其研制依據就是根據傳統中醫理論以及中醫文獻古籍關于海帶、昆布利水瀉濁作用，針對濕濁內阻證腎病綜合征腎功能衰竭的病因病機，突出中醫治療腎病的優勢，結合海洋藥物研究的最新進展和現代提取工藝而確立的。本研究結果表明，高、中、低劑量RFSE均可顯著改善模型大鼠的精神狀態、攝食等一般狀況，能顯著降低模型大鼠血清中Scr、BUN和P3+的水平，減少腺嘌呤所致的24 h尿量和尿蛋白的增加；高、中劑量RFSE還可使模型大鼠的腎臟病理改變得到一定程度的改善；各劑量RFSE對RBC和Hb的含量降低也顯示了一定的緩解作用。與同等劑量的FS比較，RFSE對24 h尿量、尿蛋白和腎臟病理改變的影響作用較好。提示RFSE對腺嘌呤所致大鼠腎功能損害有較好保護作用，能較好的延緩腎衰的進展，但至于具體的作用機制還有待進一步的研究。

綜上所述，RFSE在連續多次給藥的過程中，對腺嘌呤所致大鼠腎功能損害顯示了較好的保護作用；而且前期研究顯示RFSE急性毒性實驗ip的半數死亡劑量是FS的近5倍，相對于FS具有更高的安全性，能夠滿足CRF患者長期用藥的需要，是一種理想的治療腎衰竭的藥物，值得進一步應用于臨床研究。

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