雙藤巴布劑中青藤堿、雷公藤甲素的體外釋放與體外透皮機制研究Δ

鄧亞利，周莉玲（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程系，廣州510642；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州510405）

青風(fēng)藤、雷公藤抗炎抗風(fēng)濕療效確切，臨床上應(yīng)用廣泛。青風(fēng)藤有效成分主要為青藤堿；雷公藤有效成分主要為雷公藤內(nèi)酯醇（甲素）[1，2]。本研究擬通過合理組方，以青風(fēng)藤、雷公藤配成藥對，組成復(fù)方，制成復(fù)方巴布劑，對其合用后藥物釋放及其透皮行為進行研究，并與青藤堿、雷公藤甲素單體組成的復(fù)方巴布劑進行比較，探討外用替代口服、復(fù)方替代單方的可行性與優(yōu)越性。

筆者對2種巴布劑的體外釋藥和透皮吸收特征[3，4]進行數(shù)學(xué)模型擬合，探討制劑中藥物的釋放機制，同時考察經(jīng)皮給藥后2種有效成分局部藥物濃度隨時間變化的規(guī)律，并預(yù)期合用后其治療特點，為其他復(fù)方中藥經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的研發(fā)提供借鑒。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Summit P680型高效液相色譜儀，由PDA-100型二級管陣列檢測器、ASI-100型自動進樣器、Summit恒溫箱、Chromeceon色譜工作站組成（德國Dionex公司）；ZRS-4型智能溶出試驗儀（天津大學(xué)無線電廠）；TK-12A型透皮擴散試驗儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）；TGL-16型高速臺式離心機（上海醫(yī)療器械六廠）。

1.2 試藥

雙藤巴布劑（STEP）、青藤堿雷公藤甲素巴布劑（STP）由筆者自制（均含青藤堿 2.5 mg·cm－2、雷公藤甲素 25 μg·cm－2）；青藤堿對照品（批號：0774-200105）、雷公藤甲素對照品（批號：111567-200502）均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.3 動物

4周齡BALB/C裸鼠，♂，體重（20±2）g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供（動物生產(chǎn)合格證號：0028166）。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Diamonsil-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-磷酸鹽緩沖液（0.005 mol·L－1磷酸氫二鈉溶液，以0.005 mol·L－1的磷酸二氫鈉調(diào)pH值至8.0，再以1%三乙胺調(diào)pH值至9.0）＝55∶45；檢測波長：225 nm。理論板數(shù)按青藤堿峰計算應(yīng)不低于1500。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取青藤堿、雷公藤甲素對照品各適量，用甲醇配成每1 mL含青藤堿0.2352 mg、雷公藤甲素40.512 μg的對照品貯備溶液，貯藏，備用。精密吸取對照品貯備溶液1 mL，置25 mL量瓶中，甲醇定容，得青藤堿（9.41 μg·mL－1）與雷公藤甲素（1.62 μg·mL－1）對照品溶液，將此溶液分別進樣1、2、4、6、8、10 μL；精密吸取對照品貯備溶液5 mL，置10 mL量瓶中，甲醇定容，分別進樣1、2、4、8、12、16、20 μL。以青藤堿、雷公藤甲素進樣量（X）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得青藤堿的回歸方程為Y＝0.0281X－0.0205（r＝0.9998，n＝6）與Y＝35.142X－0.1393（r＝0.9994，n＝7）。結(jié)果表明，青藤堿進樣量在9.41～94.08 ng與0.12～2.35 μg之間與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。雷公藤甲素的回歸方程為Y＝0.0487X－0.0135（r＝0.9995，n＝6）與Y＝0.0369X+0.0356（r＝0.9999，n＝7）。結(jié)果表明，雷公藤甲素進樣量在3.24～16.20 ng與20.26～405.12 ng之間與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.1.3 精密度試驗 取“2.1.2”項下對照品貯備液（含青藤堿0.2352 mg·mL－1、雷公藤甲素40.512 μg·mL－1）、對照品溶液（含青藤堿9.41 μg·mL－1、雷公藤甲素1.62 μg·mL－1），分別按“2.1.1”項下色譜條件測定。日內(nèi)精密度（n＝6）結(jié)果：青藤堿峰面積的RSD為1.04%與1.86%，雷公藤甲素峰面積的RSD為1.22%、1.88%；日間精密度（n＝5）結(jié)果：青藤堿峰面積的的RSD為1.26%、1.93%，雷公藤甲素峰面積的RSD為1.72%、1.98%，表明該方法精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.2”項下對照品溶液適量，室溫條件下每隔2 h進樣1次，8 h內(nèi)測定4次。結(jié)果，青藤堿峰面積的RSD為1.56%（n＝4），雷公藤甲素峰面積的RSD為1.97%（n＝4），表明在室溫條件下檢測成分8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 加樣回收率測定 精密吸取青藤堿（9.41 μg·mL－1）與雷公藤甲素（1.62 μg·mL－1）對照品溶液5.0 mL，氮氣吹干，甲醇定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果，青藤堿的平均回收率為99.86%（RSD＝1.03%，n＝6），雷公藤甲素的平均回收率為97.56%（RSD＝1.02%，n＝6），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.1.6 最低檢測限測定 按信噪比（S/N）＝3作為最低檢測限，測得雷公藤甲素的最低檢測限為1.62 ng，青藤堿的最低檢測限為9.41 ng。

2.2 體外釋放度試驗

參照2005年版《中國藥典》釋放度測定第三法進行。釋放介質(zhì)為30%乙醇-生理鹽水。量取經(jīng)脫氣處理過的釋放介質(zhì)250 mL注入溶出杯內(nèi)，預(yù)溫至（32±0.5）℃。取經(jīng)皮給藥制劑各1片（面積為25 cm2），分別固定于兩層不銹鋼碟片的中央，釋放面朝上，再將網(wǎng)碟置于溶出杯下部，使制劑與槳底旋轉(zhuǎn)面平行，兩者相距（25±2）mm。開始計時，轉(zhuǎn)速為100 r·min－1，分別于1、2、4、6、8、12、16、24 h取樣5 mL，取樣位置在介質(zhì)液面與槳葉上端之間正中，離溶出杯壁距離1 cm。每次取樣后立即補充相同體積的空白釋放介質(zhì)。

取上述溶出液1 mL，氮氣吹干，甲醇定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液5 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，測定青藤堿、雷公藤甲素的峰面積，根據(jù)對照品的峰面積計算其濃度。按以下公式計算單位面積累積釋放量（Q，μg·cm－2）：

式中，Cn為第n個取樣點測得的藥物濃度（μg·mL－1）；Ci為第i（i＝n－1）個取樣點測得的藥物濃度（μg·mL－1）；D為制劑中青藤堿、雷公藤甲素含量（μg）。

青藤堿與雷公藤甲素的累積釋放量見圖1。

將STP與STEP經(jīng)皮給藥制劑的單位面積的Q分別對時間（t，h）按零級、一級與Higuchi動力學(xué)方程進行線性回歸，解釋其釋藥機制[6]。結(jié)果均以Higuchi方程擬合度較優(yōu)（STP中：r青＝0.9955，r甲＝0.9958；STEP中：r青＝0.9920，r甲＝0.9963），說明2種制劑均屬骨架型釋藥系統(tǒng)。藥物以微細(xì)的粒子混懸分散在基質(zhì)中，每單位體積基質(zhì)所含溶解與混懸藥物總量比藥物在基質(zhì)中的飽和濃度大，藥物的釋放量與時間的平方根成正比。青藤堿、雷公藤甲素以單體入藥和以浸膏入藥，在相同基質(zhì)中的釋藥速率（J）基本相同。青藤堿、雷公藤甲素的體外釋放動力學(xué)方程分別見表1、表2。

表1 青藤堿的體外釋放動力學(xué)方程Tab 1 In vitro release kinetics equation of sinomenine

表2 雷公藤甲素的體外釋放動力學(xué)方程Tab 2 In vitro release kinetics equation of triptolide

由表1、表2可知，2種經(jīng)皮給藥制劑的體外釋藥隨時間為一個遞增過程。青藤堿在STP、STEP中，24 h的累積釋放百分率（Q%）分別為83.52%、78.09%；J分別為468.5、455.58 μg·cm－2·h－1/2。雷公藤甲素在STP、STEP中，24 h的Q%分別為80.32%、75.26%；J分別為4.6112、4.3879 μg·cm－2·h－1/2。

2.3 體外透皮試驗

采用透皮擴散試驗儀[5]，先將磁攪拌子放在接收池內(nèi)，再將制備的離體裸鼠背部皮膚平放在接收池上端，角質(zhì)層面向上，然后將釋放池用夾子固定于接收池上。在接收室中注入接收液7 mL，保持（32±0.2）℃恒溫水浴，磁力攪拌轉(zhuǎn)速為（200±5）r·min－1，預(yù)平衡1 h。倒掉接收池中的溶液，加入空白接收液。釋放池中放上巴布劑，于預(yù)定的間隔時間（2、4、6、8、10、12、16 h）分別取樣5 mL，每次取樣后補加相同體積的新鮮接收液并排除接收室中的氣泡。

取上述溶出液5 mL，氮氣吹干，甲醇定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，測定峰面積，根據(jù)對照品的峰面積計算其濃度。按以下公式計算Q

式中，Cn、Ci、D的意義同“2.2”項下。

以STP、STEP中青藤堿和雷公藤的Q和Q%對t（h）分別按零級、一級與Higuchi動力學(xué)方程進行線性回歸，可知2種巴布劑的經(jīng)皮滲透可較好地擬合零級動力學(xué)方程。青藤堿在STP、STEP中的r分別為0.9951、0.9926；透皮速率（J）分別為 21.729、20.063 μg·cm－2·h－1。雷公藤甲素在STP、STEP中的r分別為0.9942、0.9902；J分別為0.4783、0.4168 μg·cm－2·h－1。STP與STEP中青藤堿、雷公藤甲素的體外透皮動力學(xué)方程分別見表3、表4。和Q%。

表3 STP與STEP中青藤堿的體外透皮動力學(xué)方程Tab 3 Transdermal rate parameters and equations of sinomenine in STPand STEP

表4 STP與STEP中雷公藤甲素的體外透皮動力學(xué)方程Tab 4 Transdermal rate parameters and equations of triptolide in STPand STEP

2.4 藥物釋放機制探討

將STP、STEP中青藤堿、雷公藤甲素的體外釋放數(shù)據(jù)代入Ritger-Peppas：Q%＝ktn模型進行擬合，判斷其從巴布劑中釋放的機制，并將兩者進行比較。結(jié)果，2種巴布劑中各組分體外釋放的擴散指數(shù)0.45＜n＜0.89，說明藥物的釋放機制是非Fick擴散（藥物的擴散和骨架溶蝕協(xié)同作用）；2種巴布劑中各組分的體外透皮指數(shù)n＜0.45，說明藥物的透皮機制是Fick擴散。STP與STEP中青藤堿、雷公藤甲素的體外Ritger-Peppas模型釋放參數(shù)見表5。

表5 STP與STEP中青藤堿、雷公藤甲素的體外Ritger-Peppas模型釋放參數(shù)Tab 5 Ritger-Peppas model release parameter of sinomenine and triptolide in STPand STEP

3 討論

釋放度是指藥物從該制劑在規(guī)定的溶劑中釋放的速度和程度。經(jīng)皮給藥過程包括藥物在基質(zhì)中擴散、在皮膚表面分配、通過皮膚滲透3個連續(xù)過程。故巴布劑的溶出度或釋放度測定在一定程度上可反映藥物在經(jīng)皮給藥裝置中的傳遞性能，為評價給藥過程的限速步驟提供參考數(shù)據(jù)。

對于經(jīng)皮給藥制劑釋放度研究，目前公認(rèn)的試驗方法是采用藥典所規(guī)定的釋放度測定第三法（小杯法），故本研究采用小杯法。小杯法中制劑的狀態(tài)較為穩(wěn)定，攪拌對基質(zhì)的影響較小，溶出液澄明度好。本研究采用的溶出介質(zhì)為30%乙醇生理鹽水溶液，在長時間的試驗中，應(yīng)注意溶出過程中的介質(zhì)蒸發(fā)量，這種損失量可能對釋放度測定結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生較大影響。

2種巴布劑中的有效成分體外經(jīng)皮滲透行為略有所不同。單體入藥的青藤堿、雷公藤甲素透皮速率均稍大于浸膏入藥的2種成分；但浸膏入藥的STEP時滯較小，推測與浸膏中其他成分存在有關(guān)。

藥物的經(jīng)皮吸收過程包括擴散和代謝2個過程。許多藥物的藥理作用的強度和持續(xù)時間取決于在機體中的代謝失活情況。所有進入活性皮膚中的藥物分子及經(jīng)皮全身性吸收的藥物分子都要經(jīng)過皮膚中酶的代謝作用。體外通透試驗很少能獲得有關(guān)代謝、分布和血流對通透性影響的信息，所以在體的透皮實驗研究很有必要[6]。

因體外釋放與體外透皮濃度變化范圍較大，故采用2條標(biāo)準(zhǔn)曲線以滿足不同檢測濃度需要；體外釋放與體外透皮取樣后，經(jīng)過氮氣吹干甲醇定容后按色譜條件進樣，對此過程造成的測量誤差進行了回收率試驗，結(jié)果表明該處理方法簡單、回收率良好。

在主要有效成分含量相同、基質(zhì)相同的STP、STEP巴布劑中，體外釋放因為溶出介質(zhì)量較大，與成分的飽和濃度相差較遠，故單體入藥與浸膏入藥釋放速率相近，無顯著性差異。而皮膚透過試驗中，因為單位面積皮膚對透過量有飽和性，在其他成分存在的情況下，可能會限制有效成分的透過速率，所得浸膏入藥的透皮速率低于單體入藥的透皮速率。

[1]劉春芳，林 娜.雷公藤甲素抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎機制研究進展[J].中國中藥雜志，2006，31（19）：1575.

[2]王 巖，周莉玲.促滲劑對青藤堿脂質(zhì)體透皮貼劑經(jīng)皮滲透的影響[J].中藥材，2005，28（7）：567.

[3]郝保華，王彥玲，李偉澤，等.青風(fēng)藤電離巴布劑電致孔透皮給藥的藥動學(xué)研究[J].中草藥，2009，40（7）：1060.

[4]高運軍，李 麗，李 文.癌痛寧巴布劑中烏頭堿的體外透皮吸收研究[J].中成藥，2008，30（11）：1619.

[5]祁 艷，陳 軍，李 磊，等.不同促滲劑對馬錢子堿貼劑體外透皮吸收的影響[J].中國藥房，2011，22（3）：195.

[6]鄭俊民.經(jīng)皮給藥新劑型[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：236、265.