肝臟特異HPPCn轉基因小鼠的建立及表型分析

文川，賽巖，白紀民，劉勇，常菁，王智，崔春萍

原發性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是居全球第 5 位的常見腫瘤，是嚴重危害人類健康的重大疾病[1]。近年來研究表明，原發性肝癌發病率呈上升趨勢，2010年數據顯示我國每年死于肝癌的人數約 34.4萬人，占全世界肝癌死亡人數的55%。肝癌切除后易復發，對化療藥物不敏感，缺乏有效的系統治療策略，且在治療過程中容易產生耐藥和復發，導致治療失敗。因此，深入研究肝癌發病機制并發展新的治療策略是關系人類健康的重大科學問題。

HPPCn（Hepatopoietin Cn）是本室從新生小牛肝臟中分離得到的一種新型肝細胞刺激因子[2]，在肝癌細胞中呈高表達，在肝癌患者的癌組織和血清中表達呈陽性。前期研究發現 HPPCn能夠特異促進肝細胞的DNA 合成和肝臟再生。為了進一步對HPPCn的功能進行研究，我們構建了攜帶小鼠白蛋白啟動子（Alb promoter）和增強子序列的HPPCn肝臟特異性表達載體，并獲得了肝臟高表達HPPCn的轉基因鼠，為研究 HPPCn 在肝癌發生過程中的功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4周齡 SPF 級 FVB/N 小鼠，軍事醫學科學院實驗動物中心提供。所有實驗用小鼠均在SPF 級動物房飼養和繁殖。溫度控制在22 ℃，濕度 70 %，自動光控（12 h 明/12 h 暗），自由采食和飲水。

1.1.2 主要試劑 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DL2000、Xhol I、Not I、BamH I、Pst I 購自中國寶生物工程（大連）有限公司；DNA 回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自美國 Qiagen公司；T4DNA連接酶、熒光定量 PCR 反應 Mix、反轉錄試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；PVDF 雜交膜購自美國 Amersham公司；Hybond+尼龍膜購自美國 Millipore公司；抗 HPPCn 單克隆抗體由本實驗室自制；地高辛標記試劑盒購自美國羅氏公司；TRIzol 試劑購自美國 Invitrogen公司；基因組提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；所有引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 攜帶 HPPCn 重組質粒的構建及轉基因小鼠的制備 將 pGEX 載體中的CMV 啟動子替換為A1bumin 啟動子和增強子序列。該質粒是在限制性內切酶 Xho I、Not I 之間插入了帶有 7個組氨酸標簽的HPPCn，即為重組質粒 pGEM-A1b/his-HPPCn。采用質粒的PCR和酶切鑒定 750 bp目的HPPCn 條帶。重組質粒 pGEM-A1b/his-HPPCn 用限制性內切酶 Apa I和Mlu I 切除其中的原核細胞 DNA 片段部分，把可以在真核細胞中表達的大片段包括 A1bumin promoter，enhancer，his-HPPCn，SV40 PolyA 尾回收供注射，片段大小約為4 kb。將回收的線性化重組片段（3～5 ng/μl）顯微注射到 FVB/N 小鼠的受精卵中[3]，并將此受精卵植入假孕 FVB/N 母鼠輸卵管中，制備首代轉基因小鼠。將已鑒定的首代轉基因小鼠與野生型FVB/N 鼠配種，對產生的子代鼠基因組進行 PCR鑒定。

1.2.2 PCR和Southern blot 鑒定轉基因小鼠 小鼠出生后的第 10 天剪下 2～3 mm的鼠尾，提取小鼠基因組，PCR 法檢測小鼠基因型。上游引物為：5' CAAATGGGAGACAAAGAG 3'，下游引物為：5' AGATGCGTGAGGTTCG 3'。PCR 反應體系 20 μl，反應條件為：94 ℃ 預變性 5 min 后開始擴增循環，循環參數為94 ℃ 變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 45 s，共 32個循環。目的基因 A1b-HPPCn 片段為650 bp。

PCR 陽性小鼠基因組10 μg 用 EcoR I 酶切2 h 后經 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳分離后轉印至Hybond+尼龍膜，然后用 PCR 擴增重組質粒pGEM-A1b/his-HPPCn的650 bp 片段為探針，按高效 DNA 地高辛標記和檢測試劑盒說明書進行Southern blot 檢測。

1.2.3 Western blot 檢測 His 標簽和HPPCn的表達 提取轉基因陽性小鼠和同窩陰性小鼠肝臟組織總蛋白，蛋白定量后，進行 SDS-PAGE 凝膠電泳（10% 濃度凝膠），蛋白經半干轉印儀轉移至PVDF 膜上，置于5% 脫脂牛奶中封閉，一抗用抗HPPCn 單克隆抗體、抗 His 標簽抗體，二抗用山羊抗小鼠抗體檢測 HPPCn蛋白和His-HPPCn蛋白表達。

1.2.4 Realtime-PCR 檢測 HPPCn mRNA的表達 用 TRIzol 試劑提取轉基因陽性小鼠和同窩陰性小鼠肝臟組織總 RNA，并以之為模板進行RT-PCR，以所得 cDNA 為模板進行 Realtime-PCR，HPPCn 上游引物為：5' ACGCCCTCTGATGT GAAA 3'，下游引物為：5' TTCTGCCAATGCTTCC AC 3'，GAPDH 上游引物為：5' GGATTTGGTCGTA TTGGG 3'，下游引物為：5' TCGCTCCTGGAAGAT GG 3'。反應條件為：95 ℃ 預變性 5 min，95 ℃ 變性 15 s，58 ℃ 退火 15 s，72 ℃ 延伸 15 s，反應共 40個循環。反應結束統計 CT 值，查看溶解曲線圖，以公式：相對表達量=1.5-△△ct統計結果。

1.2.5 組織學檢測 選用 4 月齡左右的轉基因陽性和同窩陰性小鼠，頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔取出肝臟，將部分肝臟組織固定在福爾馬林中48 h，進行脫水、包埋、切片，HE 染色。另取小塊肝臟組織固定在2.5%的戊二醛溶液中，制成透射電鏡切片。

2 結果

2.1 高表達 HPPCn 轉基因小鼠的建立

限制性內切酶 XhoI、NotI 分別酶切 pGEM載體（圖 1）和擴增的his-HPPCn 片段，將其連接轉化后，提取質粒進行 PCR 鑒定（圖 2）并對構建好的載體進行基因測序，證明 pGEM-Alb/his-HPPCn 載體構建是正確的。我們用 Apa I、Mlu I 對轉基因表達載體進行酶切（圖 3），目的是從轉基因載體上切下目的基因的片段和肝臟特異表達所需的特異性的啟動子和增強子。將所需的片段切下后回收供顯微注射。PCR（圖 4）和Southern blot（圖 5）鑒定產生的小鼠基因組型，共產生 2只首建鼠，均可傳代。現已成功繁殖到 F4 代，并未出現外源基因的丟失。

圖1 載體的酶切Figure1 Identification of pGEM by restriction enzyme digestion

圖2 目的片段的擴增Figure2 Identification of his-HPPCn fragment by PCR

圖3 注射用片段的鑒定Figure3 Identification of micro-injection fragment

圖4 轉基因小鼠 PCR 鑒定Figure4 Identification of transgenic mice by PCR

圖5 轉基因小鼠 Southern blot 鑒定Figure5 Identification of transgenic mice by Southern blot

圖6 HPPCn和His 標簽在轉基因陽性和陰性小鼠肝臟中的表達Figure6 The expression of HPPCn and His gene in liver tissues of wild type mice and transgenic mice

2.2 HPPCn 在轉基因陽性和陰性小鼠肝臟中的表達

提取 4 月齡的轉基因陽性和陰性小鼠肝臟組織總蛋白，Western blot 分析HPPCn和His 標簽在肝臟組織的表達。結果顯示，所檢測蛋白均顯著上調（圖 6）。

提取 4 月齡的轉基因陽性和陰性小鼠肝臟總RNA，Realtime-PCR 分析 HPPCn 基因的mRNA在肝臟中的表達。結果顯示，在mRNA 水平上有顯著上調（圖 7）。

圖7 HPPCn 在轉基因陽性和陰性小鼠肝臟中 mRNA 水平表達Figure7 The expression of HPPCn mRNA in liver tissues of wild type mice and transgenic mice

2.3 高表達 HPPCn 轉基因小鼠組織病理學檢測

將 4 月齡的高表達 HPPCn 轉基因陽性和陰性小鼠的肝臟和肺臟進行病理解剖，HE 染色和透射電鏡觀察。結果顯示，轉基因陽性和陰性的肝臟和肺臟細胞形態未發生明顯變化，亞顯微結構中轉基因陽性小鼠肝臟線粒體發生明顯空泡化并且線粒體數量增多（圖 8）。

3 討論

本實驗中成功構建了肝臟高表達 HPPCn 轉基因小鼠，在蛋白和分子水平上均顯示 HPPCn 含量明顯上調，為后期建立評價 HPPCn 在體內肝癌發生發展中的功能作用提供了有力工具。

圖8 轉基因陽性和陰性小鼠肝臟和肺臟組織切片 HE 染色和電鏡觀察Figure8 The sections of liver and lung tissues from the wild type mice and the transgenic mice were stained with HE and observed by TEM

本實驗中，我們著重對比了導入外源基因后FVB/N 小鼠與野生型 FVB/N小鼠之間的表型變化。首先，在外觀上，體型、毛發、體重等方面未發現明顯不同。我們對肝臟切片做了 HE 染色，在細胞排列方式、細胞形狀以及細胞核數量等方面進行比較，也未發現兩種小鼠之間有明顯的改變。并且，我們對兩種小鼠血清中的丙氨酸氨基轉移酶（ALT）含量進行了測定，其含量均在正常范圍內。其次，我們對肝臟切片做了透射電鏡觀察細胞亞顯微結構，結果顯示，轉基因小鼠肝臟細胞內的線粒體數量明顯增多，有空泡化現象，這種結果可能會影響肝臟能量代謝。之后，對于這種現象我們對兩種小鼠做了長時間的觀察和對比，結果發現無論從運動狀態、精神狀況、飲食情況以及小鼠壽命等均未出現明顯區別。最后，采用 Western blot和Q-PCR 檢測兩種小鼠肝臟內 HPPCn 表達水平時，我們發現在轉基因小鼠體內 HPPCn能持續性的高于正常水平表達。

本實驗采用的建模小鼠是 FVB/N 小鼠，FVB/N 小鼠是常用的轉基因模型鼠，因為它的繁殖能力較強，生育的子代數量多，受精卵前核大而顯著，易于外源 DNA的注射。我們設計的重組DNA 片段含有白蛋白增強子和白蛋白啟動子以及具有 His 標簽的HPPCn 片段。小鼠白蛋白主要在肝臟中表達，并在早期胚胎發育過程中開始表達[4]。其啟動子包含 CAATbox和TATAbox 及肝細胞核因子（HNF1）結合域[5]，在進化史上具有高度保守性[6]。構建含有 cDNA 序列與外源啟動子結合的重組質粒以獲得轉基因目的片段是建立轉基因小鼠的手段之一[7]。本室研究人員構建了 Alb 啟動子啟動的帶有 His 標簽的HPPCn 真核表達載體，并成功在體外對該載體肝臟表達的特異性進行了驗證。進而我們將載體上的白蛋白增強子、啟動子及目的基因片段切下后通過顯微注射方式注射到受精卵原核中，再植入假孕母鼠的輸卵管中，對產生的子代小鼠進行鑒定。

對于本實驗中篩選轉基因陽性鼠需要的PCR反應引物設計，考慮到 HPPCn的內源性基因，我們設計了可特異地檢測轉入片段的精確引物，并為了驗證其準確性，我們把轉入的片段用陰性小鼠基因組稀釋 2萬倍（按照一個重組片段在小鼠基因組中所占的比例）后仍然能擴增出目的片段，并以此稀釋液作為陽性對照。轉基因小鼠的鑒定至少需要兩次剪尾，并 PCR 鑒定結果一致才能確定，避免有假陽性結果。

HPPCn是富含亮氨酸的酸性殼蛋白，屬于LANP 家族，同屬于LANP 家族的還包括 pp32、PHAPI、Mapmodulin、I1PP2A、APRIL、pp32r1和pp32r2等，這些蛋白都參與細胞的自我更新過程，并且在一些腫瘤組織中表達較高[8-9]，HPPCn 在正常肝組織中表達量較低，經肝部分切除或誘發性肝損傷時，HPPCn的表達上調。體內、體外實驗均表明 HPPCn能刺激肝細胞的增殖[10]。本實驗是基于這些研究成果，從而構建了高表達 HPPCn 轉基因鼠，期望對 HPPCn 在肝臟疾病中所發揮的作用做更深入的研究。

總之，本實驗成功建立了肝臟特異 HPPCn 高表達轉基因小鼠，為進一步研究 HPPCn的功能和作用機制提供了有力工具。

[1]Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al.Global cancerstatistics, 2002.CA Cancer J Clin, 2005, 55(2):74-108.

[2]Radiation of the PLA Military Academy of Medical Sciences and Institute of Radiation Medicine.Liver regeneration factor and its application: China, CN200610092321.2007-01-17.(in Chinese)中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所.肝再生因子及其應用: 中國, CN200610092321.2007-01-17.

[3]Gordan JW, Ruddle FH.Integration and stable germline transmission of genes injected into mouse pronuclei.Science, 1981, 214(4526):1244-1246.

[4]Park TJ, Kim JY, Oh SP, et al.TIS21 negatively regulates hepatocarcinogenesis by disruption of cyclin B1-Forkhead box M1 regulation loop.Hepatology, 2008, 47(5):1533-1543.

[5]Teoh NC, Dan YY, Swisshelm K, et al.Defective DNA strand break repair causes chromosomal instability and accelerates liver carcinogenesis in mice.Hepatology, 2008, 47(6):2078-2088.

[6]Zimmers TA, Jin X, Gutierrez JC, et al.Effect of in vivo loss of GDF-15 on hepatocellular carcinogenesis.J Cancer Res Clin Oncol,2008, 134(7):753-759.

[7]Waxman DJ, Azaroff L.Phenobarbital induction of cytochrome P-450 gene expression.Biochem J, 1992, 281(Pt 3):577-592.

[8]Kular RK, Cvetanovic M, Siferd S, et al.Neuronal differentiation is regulated by leucine-rich acidic nuclear protein (LANP), a member of the inhibitor of histone acetyltransferase complex.J Biol Chem, 2009,284(12):7783-7792.

[9]Kadkol SS, El Naga GA, Brody JR, et al.Expression of pp32 gene family members in breast cancer.Breast Cancer Res Treat, 2001,68(1):65-73.

[10]Cui CP, Zhang DJ, Shi BX, et al.Isolation and functional identification of a novel human hepatic growth factor: hepatopoietin Cn.Hepatology, 2008, 47(3):986-995.