鏈霉菌I06A-00625發酵產物的提取分離、結構鑒定及活性研究

賈貝，何寧，趙莉莉，余利巖，蔣忠科，姜蓉

銅綠色假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是假單胞菌屬中的代表菌種，是一種重要的院內感染條件致病菌，常常感染免疫力低下的病人，引起菌血癥、肺炎、泌尿系統感染。由于銅綠色假單胞菌外膜通透性低并存在著外排多種物質的主動外排系統（active efflux systems），使得其具有先天的多重耐藥性[1]，臨床治療十分困難，一旦感染，死亡率很高，已經成為臨床醫生面臨的治療難題之一。因此，迫切需要發現新的抗銅綠色假單胞菌的藥物。

前期的研究結果發現鏈霉菌 I06A-00625（cpcc201504）的發酵液樣品具有抑制銅綠色假單胞菌生長的活性。本研究通過對 I06A-00625 發酵液抗真菌組分的分離純化，得到 6個單一化合物，對其進行結構解析并進行抗菌活性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鏈霉菌 I06A-00625、銅綠色假單胞菌（ATCC 29212）、黑曲霉菌（BM，ATCC 16404）和白色念珠菌（CA，ATCC 10231）均由本所菌種中心提供。

1.1.2 種子培養基與發酵培養基 含葡萄糖 5 g，酵母膏 5 g，蛋白胨 5 g，牛肉膏 5 g，玉米漿 4 g，黃豆餅粉 10 g，碳酸鈣 4 g，氯化鈷 0.02 g，淀粉20 g，水 1 L，pH 7.2。

1.1.3 實驗試劑及儀器 大孔吸附樹脂 X-5和葡聚糖凝膠 LH-20 為上海生化試劑廠產品；Agilent 1200A 型高效液相色譜儀和半制備色譜柱（9.4 mm×250 mm，5 μm）均為美國安捷倫公司產品；UV 2550 型紫外光譜儀為日本 Shimadzu公司產品；Varian VNS-600 型 600M 核磁共振儀為瑞士瓦里安公司產品；LTQ-Orbitrap 質譜儀為美國賽默飛世爾公司產品；高效液相用色譜純乙腈為美國 SK Chemicals公司產品；其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌種發酵 菌種I06A-00625 于瓊脂斜面培養基上 27 ℃ 培養 7 d，接種于100ml 種子培養基中，180 r/min，27 ℃ 振蕩培養 48 h。以 5%的接種量轉種至發酵培養基中，27 ℃，180 r/min 振蕩培養 96 h，發酵終點 pH 7.5。

1.2.2 提取分離 發酵液離心，棄去菌絲體，上清液過 X-5 大孔吸附樹脂，分別用無鹽水、10%、30%、50%、80% 丙酮洗脫。

對各部分洗脫液進行多種抗菌活性追蹤，10%丙酮洗脫液具有較好的抗銅綠色假單胞菌活性，將其濃縮后上葡聚糖凝膠 LH-20 柱，以 30% 甲醇洗脫，活性組分進 HPLC 純化，液相條件：流動相 18% 乙腈，流速 1ml/min，檢測波長 230 nm。收集保留時間為13.8 min的組分。

50% 丙酮洗脫液具有較好的抗真菌活性，濃縮后上葡聚糖凝膠 LH-20 柱，收集黃色、淺黃兩個色帶。淺黃色帶進 HPLC 分析，液相條件：流動相 30% 乙腈，流速 1ml/min，檢測波長 215 nm，分別在保留時間 26.1和28.5 min 時有兩個組分。黃色色帶進 HPLC 分析，液相條件：流動相 30%乙腈 35 min，37% 乙腈 20 min，流速 1ml/min，檢測波長 304 nm，在保留時間 46.8、47.8和55.3 min出現 3個活性組分。

1.2.3 抗菌活性測定 采用紙片瓊脂擴散法測定抗菌活性，用白色念珠菌和黑曲霉菌作為檢定菌。將白色念珠菌和黑曲霉菌按 1%的比例接種于LB 培養基上。將加有 40μg/ml 樣品的5 mm紙片貼于平板上，于37 ℃ 恒溫箱中培養 24 h 后測量抑菌圈的大小。

2 結果

2.1 分離純化結果

10% 丙酮洗脫液分離得到 1個具有抗銅綠色假單胞菌的活性組分，命名為I06A625A，經過初步結構鑒定確定其為核苷類化合物，具體結構正在解析。

50% 丙酮洗脫液淺黃、黃色兩個色帶共收集得到 5個單一組分，依次命名為206A、206B、206C、206D和206E。

2.2 活性化合物結構鑒定

206E 為白色無定形粉末，易溶于甲醇、乙腈、DMSO，不溶于氯仿、水。ESI-MS[M+H]+(m/z)：696.2，根據高分辨質譜并結合1H-NMR和13C-NMR 數據確定分子式為C35H53NO13，其紫外吸收分別在291、305、319 nm 波長處有最大吸收，與四烯類抗生素的紫外特征吸收一致，可以斷定其為四烯大環內酯類抗生素。根據1H-NMR和13C-NMR 譜核磁數據，查閱相關文獻[2-4]后確定其為Tetramycin A，結構式見圖 1。

206C 為白色無定形粉末，易溶于甲醇、乙腈、DMSO，不溶于氯仿、水。ESI-MS[M+H]+(m/z)：712.3，根據高分辨質譜并結合1H-NMR 數據確定分子式為C35H53NO14，根據紫外吸收特征確定為四烯類抗生素，與206E 為同一系列化合物，根據核磁數據，查閱相關文獻[2-4]后確定其為Tetramycin B，結構式見圖 1。

圖1 206E、206C、206D的化學結構Figure1 Chemical structure of 206E, 206C and 206D

206D 為白色無定形粉末，易溶于甲醇、乙腈、DMSO，不溶于氯仿、水。ESI-MS[M+H]+(m/z)：682.3，根據高分辨質譜并結合1H-NMR 數據確定分子式為C34H51NO13，與206E 為同一系列化合物，根據核磁數據，查閱相關文獻[2-4]后確定其為Tetrin A，結構式見圖 1。

206A 為白色無定形粉末，易溶于甲醇、氯仿、乙腈等有機溶劑，由 ESI-MS 確定分子量為242，分子式為C14H14N2O2，紫外最大吸收波長：224和294 nm，對其1H-NMR和13C-NMR 各峰進行歸屬后確定其為化合物 (Z)-3-benzylidenehexahydro,pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione[5-6]。結構式見圖 2。

圖2 206A的化學結構Figure2 Chemical structure of 206A

206B 為白色無定形粉末，易溶于甲醇、氯仿、乙腈等有機溶劑，由 ESI-MS 確定分子量為193，分子式為C11H15NO2，紫外最大吸收波長：215和275 nm，且在226 nm 處有肩峰，對其1H-NMR和13C-NMR 各峰進行歸屬后確定其為化合物N-(4-methoxyphenethyl) acetamide。結構式見圖 3。

2.3 活性測定

2.3.1 抗銅綠色假單胞菌活性 采用紙片擴散法進行活性測定，活性組分 I06A625A 對銅綠色假單胞菌表現出了抑制活性，但其 MIC 值大于512μg/ml。

2.3.2 抗真菌活性 采用紙片擴散法測量抑菌圈直徑，由表1 可知分離得到的3個四烯類抗生素對白色念珠菌及黑曲霉均有抑制活性。

圖3 206B的化學結構Figure3 Chemical structure of 206B

表1 化合物的抗真菌活性Table1 Antifungal activity of 5 purified compounds

3 討論

本實驗分離得到的化合物 206E和206C 分別為四烯大環內酯類抗生素 Tetramycin A和B，四烯類大環內酯類抗生素普遍具有較好的抗真菌作用[7]。Tetramycin 最早從 Streptomyces noursei的代謝產物中分離得到[8]，隨后，Radics等[3]利用核磁共振手段確定了 Tetramycin A和B的結構，并發現其對多種真菌具有較強的抑制作用，本研究也證實了其對白色念珠菌和黑曲霉菌的抑制作用。另外本研究中還發現 Tetramycin A和B 對Pseudomonas aeruginosa的SecA蛋白的ATPase 具有抑制活性，但其抑制酶活作用的機制還有待于進一步研究。

在以 3-ylidene-pyrazine-2,5-diones 為母核的衍生物合成研究中，化合物 (Z)-3-benzylidenehexahydro,pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione（206A）已被多次報道[9]，但卻是首次從天然產物中分離得到，從生源角度看可以認為是兩個氨基酸形成的環肽。

N-(4-methoxyphenethyl)acetamide（206B）被報道為合成異喹啉類物質的中間體[10]，此次在微生物代謝產物中發現，表明其很有可能也是生源途徑合成異喹啉類的中間物質。Sachchidanand等[11]還研究過其作為先導化合物在蛋白水平上對 p53穩定性的影響，并修飾了其構型。

鏈霉菌 I06A-00625 產生的多種活性組分屬于不同種類的抗生素，既有抗銅綠色假單胞菌的核苷類化合物，又同時產生抗真菌的四烯類化合物，這種同一株菌可以產生不同種類抗生素的現象也值得我們關注。

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