以肽脫甲酰基酶為靶點的抗結核藥物高通量篩選模型的建立和應用

張麗蓉，趙莉莉，魏玉珍，李秋萍，王莉寧，余利巖

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的慢性緩發型傳染病。結核病曾在全世界廣泛流行，奪去了數億人的生命[1]。異煙肼、利福平等藥物的使用一度使得結核病得到了很好的控制和治療，但近年來AIDS的蔓延和多重耐藥結核分枝桿菌的出現使得肺結核的防控形勢異常嚴峻，傳統藥物已不能滿足臨床需要[2-7]。因此，亟需加緊新型抗結核藥物的研發。

肽脫甲酰基酶（peptide deformylase，PDF）是原核生物蛋白質成熟過程中的一個關鍵酶，它在蛋白質成熟過程中起關鍵作用，主要功能就是水解原核生物的新生多肽 N 端甲酰甲硫氨酸的甲酰基。若 PDF 發生突變或缺失，病原微生物則不能生長、繁殖[8]。它在真核生物中并非必需，因此被視為理想的新一代廣譜抗生素藥物篩選分子靶點之一[9-10]。微生物的次級代謝產物是研制新藥的重要資源之一，天然產物來源的PDF 抑制劑報道很少[11-13]，這些報道的天然 PDF 抑制劑結構多為非肽類，其抑酶活性和抗菌活性都相對其他類型的化合物要低，天然來源的結核分枝桿菌的PDF 抑制劑還未見報道。本研究通過建立以肽脫甲酰基酶為靶點的高通量篩選模型，期望在微生物次級代謝產物中發現新型酶抑制活性和抗菌活性均較好的抑制劑，為開發有效的新型抗耐藥結核分枝桿菌藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Veriti 96 well Thermal Cycler PCR 擴增儀為美國 ABI公司產品；?KTA pufifierTM10 層析系統為美國 GE Healthcare公司產品；PolarFluostar 多功能熒光檢測儀為德國 BMG公司產品；三肽for-Met-Ala-Ser 為瑞士 Bachem公司產品；Actinonin和Fluorescamin 為美國 Sigma公司產品。

菌株大腸桿菌感受態 DH5α和BL21（DE3）購于上海生工生物工程技術服務公司；克隆載體pGEM-T easy 購于美國 Promega公司；表達載體pET-28a 由本室保存；細胞 293T、A549和Raw264.7 由本所免疫室惠贈；結核分枝桿菌 H37Rv基因組DNA 由北京市結核病胸部腫瘤研究所陸宇老師惠贈。

1.2 方法

1.2.2 蛋白表達載體的構建 分別用 NdeI和XhoI 對 T-def和pET-28a 進行雙酶切，獲得目的基因片段和線性化的pET-28a。用 T4 連接酶在16 ℃ 連接 20 h，連接后的重組質粒命名為pET-28a-def。并用該質粒轉化大腸桿菌 DH5α，然后涂布于含有 50 mg/L 卡那霉素的LB 平板上。37 ℃ 培養 16 h 篩選重組子，提取質粒，雙酶切鑒定載體的正確性，并測序驗證片段的正確性及插入方向的正確性。

1.2.3 重組質粒在大腸桿菌中的誘導表達和純化 用構建成功的pET-28a-def 質粒轉化 BL21(DE3)，接種于50 μg/ml 卡那霉素的LB 液體培養基中，37 ℃ 振蕩培養至OD600=0.5 時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，于20 ℃、200 r/min 旋轉培養過夜，誘導目的蛋白的表達。收獲并裂解菌體細胞，通過 SDS-PAGE蛋白電泳檢測 PDF 在BL21 中的表達。超聲裂解菌體后的裂解液于4 ℃、15000×g 離心 30 min，上清用 0.45 μm 濾膜過濾。使用 ?KTA 系統對目的蛋白進行分離純化。

1.2.4 結核分枝桿菌 PDF 抑制劑篩選模型的建立、優化、評價及應用

1.2.4.1 蛋白活性測定 PDF 水解掉甲酰化三肽底物 for-Met-Ala-Ser N 端的甲酰基后，N 端暴露出游離的NH2，游離 NH2與熒光胺反應后所產生的熒光能夠用多功能熒光檢測儀在激發光 390 nm、發射光 470 nm下檢測，熒光強度的變化直接反映了酶活性的強弱[14]。反應體系的總體積為50 μl，其中含有：20 ng PDF 酶、5 mmol/L 底物、0.06 mg/ml熒光胺。酶和底物用 pH 7.4的HEPES 緩沖液稀釋及配制，反應 30 min 后加入熒光胺，繼續反應5 min 后檢測熒光值。

1.2.4.2 篩選樣品處理 取 7ml 新鮮發酵液用等體積的丙酮抽提，離心，上清用乙酸乙酯萃取，揮干后用 DMSO 溶解。

1.2.4.3 模型的優化和評價 本研究考察了一系列溫度（15～45 ℃）、酶濃度（10～100 ng）、底物濃度（0.1～30 mmol）以及反應時間（2～30 min）對酶活性測定的影響，選擇最佳反應條件，對模型進行優化。進一步考察了 DMSO 濃度以及反應體系中各種成分對酶活性的影響。

計算下列指標：

1.2.4.4 孔板的穩定性及均一性評價 將經優化的體系于96 孔板中進行反應，分別設陰性對照和陽性對照交叉排列，每天進行 1 次體系驗證，重復 3 d。

1.2.4.5 樣品篩選 采用終濃度 1 μmol/L的放線酰胺素作為陽性對照，使用 96 孔板進行微生物發酵樣品的篩選。樣品和陽性藥分別與酶在37 ℃ 預混合 5 min。加入底物反應 30 min 后，再加入熒光胺，檢測熒光值大小。酶抑制率計算公式如下：

酶抑制率%=（F陰性對照均值－F樣品值）/（F陰性對照均值－F陽性對照均值）×100%

計算出的數值可能大于100%，表明樣品對PDF 酶的抑制作用強于陽性樣品。

1.2.5 抗恥垢分枝桿菌活性測定 采用平板紙片法（K-B 法）測定抗菌活性，用恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis mc2155）作為檢定菌。將恥垢分枝桿菌按 1.5% 接種于分枝桿菌培養基中，倒平板。將加有樣品的6 mm的紙片貼于平板上，37 ℃ 培養 24 h 后測量抑菌圈的大小。采用異煙肼作為陽性對照，可觀察到明顯抑菌圈的被認為是陽性樣品。異煙肼：50 μg/紙片；發酵液樣品：40 μl 發酵液/紙片。

1.2.6 樣品細胞毒性的測定 采用 MTT 法[15]來檢測篩選所得的陽性樣品對細胞存活的影響情況。本實驗測定的細胞包括人腎上皮細胞 293T，人肺腺癌細胞 A549和鼠單核巨噬細胞 Raw264.7，加入的發酵液終濃度為0.5%。細胞存活率計算公式為：

計算出的數值可能大于100%，表明樣品中的組分對細胞生長具有促進作用，被認為沒有細胞毒性。

2 結果

2.1 目的基因的克隆以及目的蛋白在BL21 中的表達和純化

構建的表達載體經 NdeI和XhoI 雙酶切的電泳結果與預期相符，目的DNA 片段與def 基因實際大小（594 bp）一致。經 DNA 測序結果證明，def 基因序列和插入載體的方向均無誤，重組質粒pET-28a-def 構建成功。轉入 pET-28a-def的BL21菌株經過 IPTG的誘導，目的蛋白結核分枝桿菌PDF 得到大量表達。蛋白 SDS-PAGE 電泳結果如圖 1 所示。

2.2 酶活測定及藥物篩選模型的建立、優化和評價

酶活測定結果顯示，純化所得到的PDF 酶具有較高的活性，酶與底物反應所測得的熒光值能達到 10000 左右，可用于后續高通量篩選模型的建立。

圖1 PDF的表達和純化Figure1 Expression and purification of PDF in E.coli

2.2.1 藥物篩選模型的建立與優化 考察了一系列溫度、酶濃度、底物濃度以及反應時間對酶活性測定的影響（圖 2）。反應體系經優化后，酶的最適反應條件為：反應溫度 37 ℃；反應時間 30 min；PDF 酶量 20 ng；底物 for-Met-Ala-Ser終濃度5 mmol/L。

利用雙倒數作圖法，將圖 2D 轉變為1/[ν]與1/[S]的直線關系，如圖 3 所示。從直線與x 軸的截距可以得到 1/Km的絕對值，直線與y 軸的截距可得到 1/Vmax。此圖可直觀的為酶抑制研究提供易于識別的圖形。計算即可得：酶被底物飽和時的最大反應速率Vmax=384.62 F/min，以及米氏常數 Km=0.346 mmol/L。

圖2 篩選條件的優化（A：反應溫度優化；B：反應時間優化；C：酶量優化；D：底物濃度優化）Figure2 Optimization of screening conditions (A: Optimization of reaction temperature; B: Optimization of reaction time; C:Optimization of enzyme concentration; D: Optimization of substrate concentration)

圖3 PDF 米氏常數的測定Figure3 Curve of Michaelis-Menten equation

圖4 反應體系中各成分的影響Figure4 Effect of single component on the assay

2.2.2 藥物篩選模型的評價：

⑴反應體系中各成分的影響 在反應體系中分別加入緩沖液、底物和酶，檢測其對熒光值的影響，結果見圖 4。計算該模型的信噪比，S/N=32.41 ＞3，符合篩選模型的要求。

⑵DMSO 濃度對酶活性的影響 反應體系中分別加入不同濃度梯度的DMSO，觀察對反應體系中酶活性的影響（圖 5）。結果顯示，DMSO 低于2%時，對所測定的熒光值的影響可以忽略不計。所以，本實驗在50 μl 反應體系中加入 1 μl的篩選樣品。

⑶孔板穩定性和均一性評價 實驗結果如圖 6顯示，數據不存在明顯趨勢，無明顯邊緣效應。CV陰性對照=3.78%＜20%；CV陽性對照=8.05%＜20%；Z′=0.73 ＞0.4。各項指標均符合高通量模型篩選的要求。

2.3 樣品篩選結果

圖5 DMSO 濃度對酶活性的影響Figure5 Effect of DMSO concentration on enzyme activity

圖6 孔板均一性和穩定性（A：橫向排列；B：縱向排列）Figure6 Validation of the screening assay (A: horizontal array; B: vertical array)

共篩選微生物發酵液樣品 12400 份。同時進行酶活性的篩選和抗恥垢分枝桿菌活性的篩選，將酶水平初篩抑制率大于30%和復篩抑制率大于50%的樣品定為陽性樣品，抗菌實驗中可觀察到明顯抑菌圈的被認為是陽性樣品。經過篩選，初篩得到陽性樣品 497個，占總數的4%。重復 3 次得到陽性樣品 33個，占總數的0.27%，其中 8個樣品具有抗恥垢分枝桿菌活性（表1）。

2.4 樣品細胞毒性檢測結果

對最終獲得的8個陽性樣品分別進行了293T、A549和Raw264.7 細胞毒性的檢測，加入的發酵液終濃度為0.5%，計算加入樣品后的細胞存活率。如表 2 所示，每個樣品的細胞毒性有差異，而單個樣品對不同細胞的毒性也存在一定的差異性。其中，樣品 I09AA-00657、I10AA-00705和I09AB-02482的毒性較大；I08AA-01782、I09AA-02493、I09AB-00271、I09AB-02487和I09AB-02493的細胞存活率基本為70% 以上，毒性較小，值得進一步深入研究。

表1 陽性樣品的抑酶活性及抗菌活性Table1 Inhibitory effect of positive samples

表2 陽性樣品的細胞毒性Table2 Cytotoxicity of positive samples

3 討論

PDF 對原核生物蛋白質的成熟起著關鍵作用，而在真核生物中并非必需。PDF蛋白的結構很保守，在所有原核生物中同源性都較高。除此之外，PDF蛋白還容易在體內外進行活性分析。良好的毒性選擇性和序列的保守性，以及易純化并測活等特性都使得 PDF 成為較理想的廣譜抗生素藥物篩選的分子靶點之一，利用本研究建立的篩選模型還有望篩選得到對其他病原微生物具有抑制活性的化合物。

本研究的電泳結果顯示，表達得到的目的蛋白大部分存在于沉淀中。嘗試了不同的誘導條件，可溶性蛋白表達量均沒有得到明顯改善。這可能與蛋白本身是非大腸桿菌的外源蛋白有關，其他文獻也有此蛋白可溶性較小的報道[16-17]。但由于本研究蛋白用量較小，反應體系中只需加入 20 ng PDF 酶，而純化 100ml 培養物即可得到 0.28 mg PDF 酶，足夠 10000余個樣品篩選之用，因此本研究中沒有嘗試去進一步提高可溶蛋白量的表達。純化得到的蛋白分子量略大于理論值（20.939 kD），可能與表達的蛋白為含有 His的融合蛋白有關，His 增加了蛋白的分子量。另外，蛋白中脯氨酸殘基的存在也可能影響蛋白在SDS-PAGE 電泳中的正常遷移，從而使得與預期值不符。

本研究篩選得到的33個酶水平陽性樣品中，只有 8個具有抗恥垢分枝桿菌活性。推測可能的原因為：①活性物質穿透細胞壁或細胞膜的能力較弱，無法有效進入菌體內與目的蛋白作用，生物利用度低；②盡管恥垢分枝桿菌和結核分枝桿菌具有較近的親緣關系，但兩者的PDF 酶氨基酸序列之間還是存在一定的差異性。因此，有必要在以后的工作中，進一步評價這 33個陽性樣品的抗結核分枝桿菌活性以及其對恥垢分枝桿菌 PDF 酶抑制活性。這 8個活性樣品中有 5個細胞毒性較小。細胞毒性較大的樣品也存在活性成分和毒性成分不同一的可能性，將通過后期的分離純化再次驗證。

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