腎組織中足細胞標志物synaptopodin的表達與腎臟損害關系的臨床意義

顏妍 楊琪 潘濤 馬路 汪建國 周柱亮 劉暢

(北京軍區北戴河療養院全軍腎臟病中西醫結合治療中心，066100)

腎小球臟層上皮細胞(足細胞)是腎小球固有細胞之一，參與腎小球濾過膜屏障的形成，同時也是終末分化細胞，一旦脫落后缺乏增殖再生能力，造成腎小球基底膜的不可逆性損傷[1]。在足細胞上存在多種特異性標志物，如synaptopodin、WT-1、GLEPP-1、nephrin、podocalyxin及 C3b受體等[2]。其中synaptopodin是一種與肌動蛋白微絲偶聯的蛋白，其富含脯氨酸，是一種線狀蛋白質，分子量為73.7 kDa，在機體內只表達于腎小球的足細胞和后腦的突觸內。它的功能尚不清楚，初步研究認為它在足突活動中發揮重要作用。既往研究表明，在多種腎小球疾病進展過程中均涉及到足細胞的異常變化，這點在糖尿病腎病的研究中也日益得到重視[3-4]。本研究在我們前期研究工作的基礎上[5]，采用間接免疫熒光雙標記技術，觀察synaptopodin和WT-1在糖尿病腎病患者腎組織中的表達并探討其意義。

1 材料和方法

1.1 研究對象 選取2000-05—2010-05 10年間在我院經腎活檢明確診斷為糖尿病腎病的2型糖尿病患者的腎活檢組織標本，共35例，其中男24例，女11例，平均年齡(49.3±12.4)歲。腎穿刺活檢組織經甲醛固定、石蠟包埋，2 μm厚度切片，行HE、PAS、PASM和Masson三色染色，根據組織病理改變特點分為彌漫性系膜硬化組(n=20)和結節性硬化組(n=15)?；颊吣I活檢時的年齡、病程、空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、血肌酐(SCr)、24 h尿蛋白定量(TUPr)和評估的腎小球濾過率(eGFR)經MDRD公式計算。正常對照組7例，選自因腎臟腫瘤而行切除的腎臟，所取腎組織標本遠離腫瘤部分。

1.2 腎組織內synaptopodin和WT-1的表達檢測

1.2.1 間接免疫熒光雙標記法 石蠟切片脫蠟，微波抗原修復(95℃，10 min)；10%小牛血清封閉，室溫，20 min；加小鼠抗人synaptopodin單克隆抗體(購自美國Maine生物技術公司)，4 ℃，12 h，PBS洗片，5 min×3，加FITC標記的兔抗小鼠IgG(購自北京中杉金橋生物技術公司)，室溫，20 min，PBS洗片，5 min×3；加兔抗人WT-1多克隆抗體(購自美國Santa Cruz公司)，4 ℃，12 h，PBS洗片，5 min×3，加羅丹明標記的羊抗兔IgG(購自北京中杉金橋生物技術公司)，室溫，20 min，PBS洗片，5 min×3；封片。

1.2.2 激光共聚焦熒光顯微鏡觀察并進行定量分析 激光共聚焦熒光顯微鏡為Bio-Rad型(美國，Bio-Rad公司)，采用雙通道掃描采集圖像，FITC的激發光波長為488 nm，羅丹明的激發光波長為543 nm，通過雙熒光集成圖像觀察synaptopodin和WT-1陽性染色的分布。用Imagerpro 5.0圖像分析軟件分別測量10個腎小球面積(μm2)及每個腎小球內synaptopodin和WT-1陽性面積(μm2)，計算每個腎小球synaptopodin和WT-1陽性面積百分比，取其平均值作為二者的表達指標[6]。

1.2.3 統計分析 數據以均數±標準差表示，采用非配對t檢驗；synaptopodin和WT-1陽性表達與臨床指標之間的相關性采用直線相關分析；統計軟件為SPSS 11.0，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組不同病理改變的糖尿病腎病患者的臨床病理特點 對兩組不同病理改變的糖尿病腎病患者的一般臨床情況及足細胞計數結果進行統計分析，結果顯示，與彌漫性系膜硬化組患者相比，結節性硬化組患者eGFR降低，TUPr和SCr升高，足細胞計數減少(P＜0.05，表1)。

2.2 synaptopodin和WT-1間接免疫熒光雙標記檢測結果正常對照組內synaptopodin主要呈顆粒狀表達于腎小球的基底膜區域(綠色熒光)，而WT-1主要表達于腎小球的足細胞上(紅色熒光)。圖像分析結果統計分析顯示，與正常對照組相比，糖尿病腎病患者腎小球內synaptopodin和WT-1的表達均降低，且結節硬化組較彌漫系膜硬化組降低更為顯著(P＜0.05，表2)。雙熒光集成圖像顯示synaptopodin和WT-1的表達變化一致。

表2 synaptopodin和WT-1免疫熒光圖像分析結果

3 討論

有研究表明，與足細胞及其裂孔膜相關的一些分子如synaptopodin、nephrin、podocin、WT-1等的基因突變，可導致某些先天性或家族性腎病綜合征或蛋白尿[7]，可見足細胞及其裂孔膜的完整是維系正常腎小球濾過屏障的關鍵。本研究結果也提示，synaptopodin和WT-1表達減少和消失同樣會導致足細胞及其裂孔膜的完整性受損，從而參與蛋白尿和腎小球節段硬化的形成。

研究顯示足細胞是腎小球濾過屏障中獨特的胰島素敏感細胞[8]，糖尿病發病過程中最根本的改變是胰島素對細胞敏感性降低。研究發現糖尿病腎病腎小球結構變化的特征是腎小球基底膜增厚、系膜基質積聚、進而K-W結節形成，使毛細血管濾過面積減少，導致GFR降低，但這種結構變化如何導致蛋白尿增多的機制尚未完全闡明。既往研究認為糖尿病腎病蛋白尿發生的基礎首先是血流動力學的改變，繼而腎臟局部一些細胞因子，如血管內皮細胞生長因子(VEGF)表達增多促進了蛋白尿的形成[9-10]。本研究發現，糖尿病腎病患者足細胞數及WT-1的表達均低于正常對照組，且結節性硬化組顯著低于彌漫系膜硬化組，由于足細胞在腎小球濾過屏障中的獨特作用，也表明在糖尿病腎病的形成和進展過程中存在足細胞損傷。

synaptopodin和WT-1是足細胞分化成熟的標志物，本研究發現，與正常對照組相比，糖尿病腎病患者腎小球內synaptopodin的表達下調，結節硬化組顯著低于彌漫系膜硬化組，同時synaptopodin的表達與患者TUPr呈負相關，與eGFR呈正相關，提示synaptopodin表達異常同樣參與了糖尿病腎病的進展過程。

synaptopodin表達減少一方面是足細胞數目減少所致，另一方面足細胞各種特異性標志物之間構成了足細胞特有的結構框架，如果任何一種標志物異常均可導致足細胞結構和功能的破壞，由此我們推測在糖尿病腎病形成的早期可能即存在synaptopodin異常，后者參與了足細胞的損傷過程。Blanco等[11]采用血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物對Zucker大鼠進行治療，結果發現腎小球內synaptopodin的表達上調，故腎素-血管緊張素系統活化是影響糖尿病腎病形成和進展中synaptopodin表達減少的重要因素之一，但在此過程中是否還存在其他調控因素影響synaptopodin的表達尚需進一步研究證實。

綜上所述，足細胞的異常對于腎小球疾病的發展及預后產生重要的影響，Synaptopodin等足細胞標志物的發現為今后腎小球疾病的研究提供了新的切入點。synaptopodin表達減少可能參與了足細胞損傷，后者促進了糖尿病腎病的形成和進展。但在此過程中是否還存在其他調控因素影響synaptopodin的表達尚需進一步研究證實。然而我們認為針對足細胞分子標志物的干預將可能成為延緩糖尿病腎病進展的重要治療措施。

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