UPLC-UV法應用于丹紅注射液多個活性成分的穩定性研究*

楊 靜 ，劉海濤 ，王躍飛 ，朱 彥

（1.天津中醫藥大學，天津市現代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室（培育），天津 300193；2.天津國際生物醫藥聯合研究院中藥新藥研發中心，天津 300457）

丹紅注射液是由丹參、紅花經科學配伍并采用現代制劑工藝制成的中藥復方注射劑，具有活血化瘀、通脈活絡的作用，臨床上常用于預防治療心絞痛、動脈粥樣硬化等心腦血管疾病[1-2]。中藥注射劑具有起效快、療效可靠等優點，但由于中藥注射液化學成分復雜，在其整個生產、儲運和使用過程中化學成分會發生諸多變化，中藥注射液的穩定性成為臨床安全性問題的潛在隱患，是阻礙中藥注射液廣泛應用的主要問題之一。其工藝、物理、化學等方面的因素是影響中藥注射液穩定性的主導因素，而中藥注射劑的配伍使用問題也是其影響因素之一[3]。因此，本實驗通過采用已建立的超高效液相色譜-紫外法（UPLC-UV）對丹紅注射液中16個主要活性成分進行測定，研究丹紅注射液在高溫、強光照射，與5%葡萄糖注射液和0.9%氯化鈉注射液配伍后活性成分的穩定性情況，為丹紅注射液的儲運和臨床應用提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters ACQUITY超高效液相色譜儀（四元泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、TUV檢測器、MassLynx V4.1色譜工作站），Milli-Q超純水系統（美國，Millipore公司），恒溫恒濕箱Climacell 11222（德國，MMM 公司）。

1.2 試藥 丹紅注射液（批號：110420）由菏澤步長制藥有限公司提供；腺苷（110879-200202）、尿苷（110887-200202）、苯丙氨酸（140676-200405）、5-羥甲基糠醛（111626-200906）、原兒茶酸（110809-200604）、原兒茶醛（110810-200506）、咖啡酸（110885-200102）、丹酚酸B（111562-201110）和羥基紅黃色素A（111637-201106）購于中國食品藥品檢定研究院，胞苷、丹參素、紫丁香苷、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸A和丹酚酸C購于天津中新藥業研究中心，其純度≥98%；0.9%氯化鈉注射液（山東華魯制藥有限公司，批號：B10120905），5%葡萄糖注射液（天津津蘭藥業有限公司，批號：10122202），乙腈、甲醇和甲酸（色譜純，德國Merck公司）；超純水（Milli-Q 凈化，0.22 μm 濾膜），其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 影響因素實驗 見參考文獻[4]。

2.1.1 高溫實驗 隨機取同批次的6支丹紅注射液放入恒溫恒濕箱中，于60℃溫度下避光放置10 d，于第5天和第10天取樣，分別測定其16個主要活性成分的含量。

2.1.2 強光照射實驗 隨機取同批次的6支丹紅注射液放入裝有日光燈的恒溫恒濕箱中，于強度為（4500±500）lx的條件下放置10 d，于5 d和 10 d取樣，分別測定其16個主要活性成分的含量。

2.1.3 供試品溶液的制備 分別精密量取2.1.1和2.1.2項下的丹紅注射液1 mL置于5 mL棕色容量瓶中，用50%甲醇水溶液定容。取2 μL溶液注入UPLC，測定含量。

2.2 配伍穩定性實驗 見參考文獻[5]。

2.2.1 丹紅注射液與氯化鈉、葡萄糖注射液的配制按照丹紅注射液說明書要求，在潔凈條件下，取1 mL丹紅注射液，分別用5 mL 0.9%氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液稀釋。

2.2.2 光照、溫度對配伍后溶液的影響 將2.2.1所得溶液密封放入恒溫恒濕箱中，于25℃或37℃溫度下避光或強度2500 lx條件下放置，于0、1、2、3、4 h取樣。取0.6 mL溶液與0.2 mL甲醇混合后測定其含量。

2.3 色譜條件及方法學考察[6]

2.3.1 色譜條件 Agilent Zorbax RRHT SB-C18柱（4.6 mm×100 mm，1.8 μm），以 0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動相，梯度洗脫，0-2 min（97%A），2-5 min（97%A～96%A），5-6 min（96%A～93%A），6-13 min（93%A～88%A），13-15 min（88%A～86%A），15-29 min（86%A～79%A），29-31 min（79%A），31-34 min（79%A～75%A），34-37 min（75%A），37-42 min（75%A～64%A），42-45 min（64%A～50%A）；流速0.5 mL/min；柱溫40℃；TUV檢測器，檢測波長為：核苷類成分260 nm、苯丙氨酸和紫丁香苷257 nm、酚酸類成分及5-羥甲基糠醛286 nm、羥基紅花黃色素A 403 nm。色譜圖見圖1。

2.3.2 方法學考察 已建立的UPLC-UV法經過系統的方法學研究，能滿足穩定性實驗的要求。方法學考察包括線性關系（r≥0.999）、定量限（0.038～0.756 μg/mL）、檢測限（0.011～0.227 μg/mL）、精密度（日內精密度、日間精密度RSD≤2.3%）、重復性（RSD≤2.0%）、穩定性（4℃下8 h穩定）和加樣回收率實驗（91.47%～108.46%，RSD≤3.1%）。

2.4 穩定性實驗結果

2.4.1 影響因素實驗結果影響因素的實驗目的是探討藥物的固有穩定性、了解影響其穩定性的因素及可能的講解途徑與降解產物，為制劑生產工藝、包裝、貯存條件和建立降解產物分析方法提供科學依據。

以丹紅注射液中各成分的含量為參照（即穩定性研究中0 d的測定結果），計算不同采樣時間樣品各成分相對于0 d測定結果的相對百分比，結果見表1。5-羥甲基糠醛、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A和丹酚酸C的含量在強光照射下有明顯降低，其中丹酚酸A降低最明顯。5-羥甲基糠醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A和丹酚酸C的含量在高溫下明顯降低，其中丹酚酸C降低最明顯，而紫草酸含量明顯升高。在高溫條件下丹紅注射液中紫草酸升高的原因主要是丹酚酸B在高溫下其酯鍵水解脫去一分子丹參素后形成紫草酸，如圖2所示，與文獻報道一致[7]。

2.4.2 配伍穩定性實驗結果本實驗考察了丹紅注射液與不同注射液混合（5%葡萄糖注射液或0.9%氯化鈉注射液）（1∶5）后16個活性成分含量變化情況，并模擬臨床用藥條件（溫度：25°C和37℃；光照：光照射和避光）對其配伍后樣品穩定性做進一步的深入研究，為合理臨床用藥提供依據。

丹紅注射液與5%葡萄糖注射液或0.9%氯化鈉注射液（1∶5）混合后0 h丹酚酸B、丹酚酸A和丹酚酸C的含量均有明顯降低，并且與0.9%氯化鈉注射液混合后上述成分下降更明顯；丹紅注射液與5%葡萄糖注射液混合后5-羥甲基糠醛含量明顯升高，原因為5%葡萄糖注射液中含有一定量的5-羥甲基糠醛，結果見圖3；其他成分含量未發生變化。在不同溫度和光照條件下，在4 h內丹酚酸B等14個成分的含量不隨時間延長而變化；丹酚酸A隨著時間延長不斷降低；丹酚酸C隨著時間延長不斷升高。丹酚酸A和C相反的變化趨勢不同是由于丹酚酸A的酚羥基和雙鍵發生氧化環合反應生成丹酚酸C，這一現象與Xu等[8]的報道一致。不同光照條件（光照或避光）下丹酚酸A或C的變化趨勢一致。不同溫度下，丹紅注射液與5%葡萄糖注射液或0.9%氯化鈉注射液混合后在37℃下丹酚酸A和C變化更明顯。研究結果見圖4。

表1 在高溫、強光照射下丹紅注射液16種主要成分的含量變化情況Tab.1 Change of 16 main components in Danhong injection under high temperature or strong lighting %

3 討論

高溫和強光照射都會影響丹紅注射液中化學成分的穩定性，其中酚酸類化合物對熱和光均不穩定，而酚酸類成分是丹紅注射液的主要有效成分，具有抗氧化、抗血小板聚集、抑制血栓形成等作用。因此在丹紅注射液的貯存和運輸過程中要盡量避免高溫和強光照射。

葡萄糖注射液中含有一定量的5-羥甲基糠醛，當其與丹紅注射液配伍后使5-羥甲基糠醛含量進一步升高。因5-羥甲基糠醛具有致敏性，中華人民共和國藥典2010版對其在葡萄糖注射液中有明確的限量規定。因此，從本實驗結果分析，在丹紅注射液的臨床應用中，在條件允許的情況下應首選0.9%氯化鈉注射液和丹紅注射液混合使用，減少因5-羥甲基糠醛導致的臨床不良反應的發生。

[1]魏艷陽，周明銀.丹紅注射液治療冠心病不穩定型心絞痛臨床觀察[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2009，7（1）：95－96.

[2]盧軍利，朱愛華，董 艷，等.丹紅注射液對冠心病患者血管內皮依賴性擴張功能的影響[J].中國醫藥導刊，2008，10（5）：708－709.

[3]黃江虹.影響中藥注射劑穩定性的相關因素研究[J].時珍國醫國藥，2007，18（5）：1271－1272.

[4]中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010：附錄199-201.

[5]王 冰，朱薇婕，曾曉麗，等.丹參凍干粉針中丹酚酸B穩定性研究[J].中成藥，2007，29（10）：1479－1482.

[6]Liu HT,Wang YF,Olaleye Olajide,et al.Characterization of in vivo antioxidant constituents and dual-standard quality assessment of Danhong injection[J].Biomedical chromatogr,DOI 10.1002/bmc.2842.

[7]Zheng XT,Qu HB.Characterisation of the degradation of salvianolic acid B using an on-line spectroscopic analysis system and multivariate curve resolution[J].Phytochem Anal,2012,23(2):103-109.

[8]Xu JZ,Zeng SH,Chen XY,et al.Isolation and identification of degradation products of salvianolic acid A by NMR and LC-MS[J].Fitoterapia,2011,82(2):260-266.