火針對大鼠脊髓損傷后運動功能及BDNF表達的影響*

李 巖，程素利，周 震，焦召華，陳 爽

（1.天津市公安醫院，天津 300042；2.天津中醫藥大學，天津 300193；3.天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300150）

脊髓損傷（SCI）是一種嚴重的中樞神經系統損傷，因中斷了通過損傷區的神經元軸突，導致損傷節段以下癱瘓、感覺缺失及自主神經障礙，在身體、心理及經濟上給個人和社會造成很大負擔[1]。臨床上，火針對SCI后功能恢復具有一定治療作用[2]，為探討其產生療效的可能作用機制，本課題組就火針對實驗性SCI大鼠腦源性神經營養因子（BDNF）蛋白表達及運動功能的影響進行相關研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組及動物模型制備 選擇健康SD大鼠60只（雌雄不拘），體質量250～300 g（由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2007-0001）；所有大鼠均在標準條件下統一喂養。

1.1.1 動物分組 采用隨機對照研究方法，按抓出順序編號并采用隨機數字表分為假手術組，模型組，火針干預組，每組又分為 1 d，3 d，5 d，7 d，4 個時相，每個時相各5只大鼠（時相的選擇根據相關國內外文獻確定[3]）。

1.1.2 動物模型制備 急性SCI動物模型建立采用改良的Allen’s法[4]。即采用20 g/L戊巴比妥鈉（40 mg/kg體質量）腹腔注射麻醉，取后正中切口，切除T9棘突、部分T10棘突和部分椎板，暴露硬膜，質量為10 g的鐵錘從25 mm高處自由落下，撞擊硬膜囊，撞擊能量為25 mm×10 g，損傷直徑為2.5 mm。與脊髓接觸的撞桿底端呈弧狀凹陷，直徑2.5 mm，與脊髓表面相吻合。撞擊成功的標志為大鼠尾巴痙攣性擺動，雙下肢及身體回縮樣撲動，雙下肢呈弛緩性癱瘓。假手術組只做T9-T10椎板切除術。術后小心護理飼養，每天擠壓排尿3次，直到反射性膀胱排空建立。

1.2 治療方法

1.2.1 穴位選取 根據“經脈所過，主治所及”針刺原則，參照中國針灸學會實驗針灸分會制定的《動物針灸穴位圖譜》及《實驗針灸學》選取穴位。取大鼠脊髓損傷部位上下端的棘突間隙，相當于T7、T8及T11、T12部位，各旁開0.5 cm，共4個穴，8個針刺點。

1.2.2 操作方法 火針組：選擇所刺穴位，體位固定，充分消毒后，左手持酒精燈于胸前，盡量接近針刺的部位；右手拇、食指、中指微屈夾持針柄，針尖方向指向欲刺部位，置火針于酒精燈火焰的外上1/3（即外焰）處，先加熱針體，再加熱針尖，要求加熱至通紅，然后施針于患處。采用快針法，每穴僅刺1次，深度為3～5 mm。造模后即行針刺1次，之后每隔24 h針刺1次。

1.3 行為學評分 行為學評分采用BBB法[5]對各組不同時相動物進行行為功能評分。

1.4 BDNF免疫組織化學染色

1.4.1 取材 行為學評分后處死動物，采用灌注法取材，即0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液，YZ9901型恒流泵60 mL/min持續6 min，快速沖洗血管床，可見肝臟發白，為灌注正確。4%多聚甲醛溶液，YZ9901型恒流泵40 mL/min持續8 min，身體逐漸僵硬顏色變白為止。小心剪開大鼠脊柱，注意保持脊髓的完整，以脊髓損傷區為中心取出長約1 cm脊髓段，將取下的標本放入新鮮固定液（4℃）固定，備做石蠟切片。

1.4.2 免疫組化SABC法檢測 二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；自來水和蒸餾水各洗5 min；0.3%H2O2的甲醇溶液室溫孵育10 min；蒸餾水洗5 min，0.01 mol/L PBS浸泡5 min；0.5%Triton x-100浸泡10 min，增加組織通透性；0.01 mol/L PBS 沖洗，5 min×3 次；滴加即用型復合消化酶，37℃恒溫水浴20 min；0.01 mol/L PBS沖洗，5 min×3次；10%正常山羊血清封閉，真空25℃孵育10 min；滴加適量一抗工作液（1∶100 BDNF抗體）在濕盒4℃放置48 h；室溫放置1 h，0.01 mol/L PBS沖洗，5 min×3次；滴加適量生物素標記二抗工作液（1∶100，山羊抗兔 IgG），真空 25℃孵育 10 min；0.01mol/LPBS沖洗，5min×3次；滴加適量的SP-HRP（1∶100），真空 25℃孵育 10 min；0.01 mol/L PBS 沖洗，5 min×3次；DAB室溫顯色，顯微鏡下控制反應時間；自來水充分沖洗；蘇木素輕度復染；再經梯度乙醇和二甲苯脫水，透明；中性樹脂膠封片。

1.4.3 免疫組化結果判定 以PBS代替一抗作陰性對照，胞漿內出現棕黃色顆粒為BDNF陽性。

2 統計學處理

采用SPSS18.5統計軟件包進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果與分析

3.1 各組大鼠BBB評分比較 手術后，模型大鼠雙后肢運動功能無明顯變化，僅個別動物可出現1個或2個關節的輕微運動，BBB評分均為0～1分，隨后BBB評分逐漸上升。1周后，火針治療組與模型組比較，顯示出一定的差異。采用火針治療后，可促進大鼠后肢運動功能的恢復，與模型對照組比較差異有統計學意義。各組大鼠1周內BBB評分情況比較，結果見表1。

表1 各組大鼠一周內BBB評分情況比較（±s）Tab.1 Comparison of the BBB scores of rats in each group in a week（±s）分

表1 各組大鼠一周內BBB評分情況比較（±s）Tab.1 Comparison of the BBB scores of rats in each group in a week（±s）分

注：與模型組比較，*P＜0.05。

組別假手術組模型組火針組n 2020201 d 3 d 5 d 7 d 20.00±1.0020.00±1.0020.00±1.0020.00±1.0000.97±0.0501.25±0.0602.00±0.1002.50±0.1201.22±0.0602.44±0.1202.75±0.14004.13±0.21*

3.2 各組大鼠BDNF表達情況比較 采用光鏡在×50、×100、×200、×400 等不同倍數下整體瀏覽切片后，×200采集圖片，BDNF圖像分析采用美國Media Cybernetics公司Image-Pro Plus圖像分析軟件測定各組標本陽性神經元細胞的個數。結果顯示，假手術組各時間點BDNF均有少量表達，火針組和模型組在傷后BDNF陽性神經元數逐漸增加，3 d、5 d、7 d時相火針組與模型組相比均具有明顯差異（P<0.05）。結果見表2。

表2 各實驗組BDNF陽性運動神經元計數比較（±s）Tab.2 Comparison of the counts of BDNF positive motor neurons in each group（±s）分

表2 各實驗組BDNF陽性運動神經元計數比較（±s）Tab.2 Comparison of the counts of BDNF positive motor neurons in each group（±s）分

注：與模型組比較，*P＜0.05。

組別假手術組模型組火針組n 2020201 d 3 d 5 d 7 d 16.2±1.0716.0±0.7116.8±1.07* 16.8±0.68☆19.6±1.2920.8±1.1626.0±1.87☆ 28.2±0.73☆21.0±1.1027.8±1.39* 29.4±1.29* 34.4±1.08*

3.3 BBB與BDNF相關性分析 對火針組大鼠BBB評分及BDNF陽性神經元計數進行相關性分析，相關系數r=0.991，回歸方程為Y（BBB）=-3.393+0.214X（BDNF），表明兩者呈高度正相關。

4 討論

腦源性神經營養因子BDNF在中樞神經損傷后再生修復和防止神經細胞退行性變等多方面發揮著至關重要的作用[6]。本研究發現，火針能增加SCI大鼠脊髓BDNF的表達，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05），表明火針具有保護運動神經元，減輕變性壞死的作用；火針組的各時間點BBB評分均高于模型組，特別是在造模并干預7 d后效果更加顯著（P＜0.05），且與BDNF表達呈高度正相關，說明火針具有促進SCI后大鼠運動功能的恢復，其作用機制與促進BDNF表達有關。

近幾年，國內外對SCI治療的研究多集中在具有自我復制和多向分化潛能的神經干細胞（NSCs）上，外源性NSCs移植已在臨床得到初步應用[7]。但外源性NSCs移植存在體內排異及倫理學的障礙，因此誘導內源性NSCs增殖并分化為神經元細胞，進而參與神經修復越來越被廣泛關注[8]。但是，也有研究顯示，SCI后誘導的內源性NSCs最終大多分化為星形膠質細胞，并參與了疤痕的產生，形成組織屏障，進而阻礙脊髓神經通路的重建[9]。因此如何誘導NSCs定向分化為神經元細胞是目前應用內源性NSCs治療SCI的難點和熱點。有研究已經證實，BDNF能促進NSCs增殖[10]，并能誘導其分化為成熟神經元細胞，促進其突起生長[11]。同時，有學者進行了離體狀態下BDNF對人脊髓NSCs增殖分化影響的研究，發現BDNF抗體封閉組神經球及神經元數目明顯減少，證實了BDNF能促進NSCs增殖并向神經元分化[12]。

通過本研究發現，火針可通過促進BDNF表達，從而對SCI發揮神經保護作用。那么，在此基礎上，火針是否同時具有神經修復作用呢？結果尚未可知。但大量文獻已證實BDNF可促進NSCs增殖并向神經元分化，產生神經修復作用。因此，可初步推斷火針可能會通過激活并增加BDNF表達，進而對NSCs產生一定的影響，但具體機制及效應如何，尚需進一步研究。

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