雷洛昔芬對絕經期后乳腺癌VEGF、Ki-67、CD34抗原表達的影響

侍曉辰 張衛東 周仕萍

乳腺腫瘤的生長、轉移與腫瘤細胞的增殖活性及腫瘤血管的形成密切相關[1]。雷洛昔芬是第2代選擇性雌激素受體調節劑（selective estrogen recep?tor modulator，SERM），與第1代他莫昔芬相比，它們對降低高危女性乳腺癌的發病率效果相當[2]；但雷洛昔芬可降低血脂、預防及治療骨質疏松，在治療劑量下不升高子宮內膜癌的發病率[3]。最近國外有文獻報道，雷洛昔芬可降低乳腺腫瘤細胞的增殖活性[4]，但關于雷洛昔芬抗血管形成作用的研究尚少見。本文旨在對采用雷洛昔芬治療的絕經期后乳腺癌患者進行觀察，探討雷洛昔芬對乳腺癌血管內皮生長因子（VEGF）、Ki-67、CD34 抗原表達的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年1月—2010年12月于無錫市中醫醫院乳腺外科就診且病理確診的女性乳腺癌患者20例，年齡52～81歲，平均（63.6±9.3）歲；腫瘤直徑3～5 cm，平均（3.4±0.5）cm。入選標準：絕經1年以上；既往無乳腺癌放、化療史；根據國際抗癌聯盟TNM分期法（2003）乳腺癌Ⅱ期；組織學類型為浸潤性導管癌；雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性。

1.2 方法 對患者進行嚴格的病史詢問、全身體檢、B超及鉬靶片檢查；懷疑惡性腫瘤者采用脈默通活檢系統（美國強生公司）行組織病理學檢查及免疫組化檢測，確診為乳腺浸潤性導管癌且ER陽性者，簽署治療知情同意書后，予雷洛昔芬60 mg/d，連續服藥21 d后行乳腺癌改良根治術，術后再次行病理學檢查及免疫組化檢測。組織標本以10%福爾馬林浸泡，石蠟包埋，5μm厚連續切片，免疫組化檢測主要試劑為鼠抗人VEGF單抗（Da Ko公司）；鼠抗人Ki-67、CD-34單抗（Santa Cruz公司）；S-P試劑盒與DAB顯色劑（福建邁新公司），染色程序按試劑盒說明進行。以PBS代替一抗設立陰性對照。

1.3 觀察指標及結果判定 （1）VEGF陽性判定標準：VEGF陽性細胞以細胞質中出現特異性染色為標準，每張切片由2名病理醫師雙盲觀測5個400倍鏡視野，以染色強度計分，與陰性對照相同計0分，淡黃色、棕黃色、黃褐色分別計1、2及3分；再以陽性細胞比例計分，全部陰性0分，1%～25%，26%～75%，76%～100%細胞數陽性分別計1、2、3分，兩項得分相加，≥3分判定為陽性。（2）Ki-67陽性細胞百分數判定：Ki-67陽性細胞以細胞核出現棕黃色染色為標準，每張切片由2名病理醫師在400倍鏡視野下雙盲計數1 000個細胞，自Ki-67陽性表達最強區域開始計數，計算染色細胞百分比，取平均值。（3）微血管密度（microvessel density，MVD）判定：根據Weidner標準[5]，被CD34單抗染成棕色或棕黃色的單個內皮細胞或內皮細胞群者，作為一個微血管單位，先在40倍鏡觀察全視野，選出5個血管豐富的“熱區”，2名病理醫師在400倍鏡視野下雙盲計數染色的微血管3次，取平均值。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計學軟件進行數據處理，雷洛昔芬治療前后的配對計數資料比較采用Mc Nemar’s檢驗，配對計量資料組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 雷洛昔芬對乳腺癌VEGF的表達的影響 3例治療前VEGF陰性患者治療后仍為陰性。17例（85%）治療前VEGF陽性的患者中，11例治療后VEGF轉陰，6例（30%）仍為陽性。治療前后陽性率比較差異有統計學意義（χ2=12.38，P<0.01）。雷洛昔芬治療前組織標本中可見大量棕色的VEGF陽性細胞，見圖1a；治療后染色細胞明顯減少，且染色變淺，見圖1b。

2.2 雷洛昔芬對乳腺癌Ki-67表達的影響 雷洛昔芬治療前Ki-67陽性細胞的百分數為（19.36±1.66）%，組織標本中可見大量棕黃色的Ki-67陽性細胞，見圖2a；治療后Ki-67陽性細胞的百分數下降至（12.24±1.42）%，組織標本中棕黃色的Ki-67陽性細胞明顯減少，治療前后陽性率比較差異有統計學意義（t=2.86，P<0.01），見圖2b。

Figure1 Immunohistochemical expression VEGF(SP×400)圖1 VEGF表達的免疫組化定位（SP×400）

Figure2 Immunohistochemical expression of Ki-67(SP×400)圖2 Ki-67表達的免疫組化定位（SP×400）

2.3 雷洛昔芬對乳腺癌CD34表達的影響 雷洛昔芬治療前CD34抗原標記的腫瘤微血管數量為46.25±3.88；組織標本中可見較多棕黃色的血管內皮細胞或內皮細胞簇，見圖3a；治療后腫瘤微血管數量下降至23.64±1.53，組織標本中棕黃色的血管內皮細胞或內皮細胞簇明顯減少，治療前后腫瘤微血管數量差異有統計學意義（t=2.93，P<0.01），見圖3b。

Figure3 Immunohistochemical expression of CD34(SP×400)圖3 CD34表達的免疫組化定位（SP×400）

3 討論

腫瘤細胞的增殖活性及腫瘤的微血管形成在乳腺癌的生長和轉移中發揮核心作用[1]。Ki-67表達于腫瘤細胞的細胞核，是一種細胞增殖相關蛋白，反映細胞的增殖活性；VEGF表達于腫瘤細胞的細胞質，是腫瘤血管生成的最主要調控因子；CD34抗原特異性表達于血管內皮細胞，常作為微血管標記物。

雷洛昔芬可用于乳腺癌的內分泌治療，也可作為乳腺癌高危人群的預防性用藥，其常用劑量為60 mg/d[2]。國外2項關于雷洛昔芬對乳腺癌作用的臨床試驗中的用藥時間分別為14 d和22 d[4，6]。本研究選擇的用藥時間為21 d，是根據我院門診病理回報至患者住院檢查并手術的等待時間為21 d所設定。本研究中首次病理標本獲取是通過麥默通活檢系統，主要考慮原因為其抽取的標本量大，且完整、連續，方便病理科醫生做出組織學報告；對其取材所得病理診斷和免疫學指標與常規手術取樣所得結論一致；且對確診為乳腺癌的患者再行手術或先行新輔助化療或內分泌治療后手術，不影響整體療效[7]。

Lopes-Costa等[4，6]報道雷洛昔芬可抑制乳腺癌細胞的增殖活性。本研究顯示雷洛昔芬可降低乳腺癌組織Ki-67陽性細胞百分數，抑制腫瘤細胞增殖活性，與上述文獻報道一致。此外，Dowsett等[6]研究顯示，雷洛昔芬只抑制ER陽性的乳腺癌細胞增殖活性，因而本組研究選擇對象均為ER陽性。Blackwell等[8]報道他莫昔芬具有抑制乳腺腫瘤組織血管形成的作用，他莫昔芬的抗血管形成效應在ER陰性的動物模型中依然存在，并且認為藥物作用并非完全依賴ER，可能是對促血管形成因子的直接作用，如VEGF。但目前國內外關于雷洛昔芬抗血管形成作用的文獻報道較少。本研究結果顯示，雷洛昔芬可降低乳腺癌組織MVD，抑制腫瘤血管形成，提示雷洛昔芬可明顯降低乳腺癌組織的VEGF陽性率。Mirkin等[9]研究顯示，雷洛昔芬可上調乳腺癌組織中內源性血管生成抑制因子血小板反應蛋白1（TSP-1）mRNA，從而增加腫瘤組織TSP-1表達；王紅超等[10]研究認為，腫瘤血管生成是促血管生成因子和血管生成抑制因子相互作用的結果，乳腺癌組織TSP-1表達增強，可影響VEGF的表達強度，降低腫瘤組織MVD，抑制腫瘤血管形成。

綜上所述，雷洛昔芬60 mg/d治療21 d可抑制乳腺癌細胞的增殖活性及微血管形成，降低腫瘤組織VEGF的陽性率，但其間的相互關系及機制仍需進一步研究加以論證。本研究結果也為進一步探討腫瘤細胞的增殖與微血管形成間的相關性，以及VEGF的靶向治療提供一定的參考。

[1]Shivakumar S,Prabhakar BT,Jayashree K,etal.Evaluation of se?rumvascular endothelial growth factor(VEGF)and microvessel den?sity(MVD)as prognostic indicators in carcinoma breast[J].JCancer Res Clin Oncol,2009,135(4):627-636.

[2]Cuzik J,DeCensi A,Arun B,etal.Preventivetherapy for breast can?cer:aconsensusstatement[J].Lancet Oncol,2011,12(5):496-503.

[3]Palacios S.Selective estrogen receptor modulators:the future in menopausal treatment[J].Minerva Ginecol，2011,63(3):275-286.

[4]Lopes-Costa PV,dos Santos AR,dos Santos LG,etal.Evaluation of Ki-67 and Bcl-2 antigen expression in breast carcinomas of women treated with raloxifene[J].Cell Proliferation，2010,43(2):124-129.

[5]Weidner N,Folkman J,Pozza F,etal.Tumor angiogenesis:a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma[J].JNatl Cancer Inst，1992,84(24):1875-1887.

[6]Dowsett M,Bundred NJ,Decensi A,etal.Effect of raloxifene on breast cancer cell Ki67 and apoptosis:a double-blind,place?bo-controlled,randomized clinical trial in postmenopausal patients[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2001,10(9):961-966.

[7]顧軍,于澤平,王少華，等.麥默通微創活檢系統對乳腺腫塊診斷的應用價值[J].醫學研究生學報,2010,23(3):279-281.

[8]Blackwell KL,Haroon ZA,Shan S,etal.Dewhirst MW:Tamoxifen inhibits angiogenesis in estrogen receptor-negative animal model[J].Clin Cancer Res,2000,6(11):4359-4364.

[9]Mirkin S,Wong BC,Archer DF.Effects of 17beta-estradiol,proges?terone,synthetic progestins,tibolone,and raloxifene on vascular en?dothelial growth factor and Thrombospondin-1 messenger RNA in breast cancer cells[J].Int JGynecol Cancer,2006,16(2):560-563.

[10]王紅超,李海平,范忠林,等.血小板反應蛋白1在乳腺癌中的表達及意義[J].天津醫藥,2009,37(10):826-827.