Notch1受體和配體分子Jagged1蛋白在肝癌組織中的表達及意義

劉 虹，李 建

（1.中南大學湘雅醫院，湖南 長沙 410008；2.長沙市中心醫院 B超室，湖南 長沙 410008）

Notch信號通路存在于許多動物體內，Notch信號通路作為一種進化保守的細胞間相互作用機制，影響細胞分化發育及凋亡。目前在脊椎動物中共發現4個同源體Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。其中Notch1不僅對正常細胞分化起重要作用，而且與一些腫瘤的發生發展相關。Notch1在腫瘤中有截然相反的兩種作用，至于其是癌基因還是抑癌基因。目前尚存爭議。Notch1信號通路是許多重要細胞信號傳導通路的交匯點，對Notch1的研究可進一步闡明腫瘤的發生機制，為腫瘤的基因治療及新藥開發提供一個新的有希望的靶點。但是，目前尚未見國內外研究Notch1與肝癌中作用的報道少見。因此，本研究擬通過檢測Notch1、Jagged1在肝癌組中的表達，初步探討肝癌組織中Notch1、Jagged1的表達與肝癌細胞分化程度的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來源于中南大學湘雅醫院2010年1月～2011年1月經病理檢查證實的肝癌樣本150例和及其相應癌旁正常組織。其中，男98例，女52例，年齡32～72歲，中位年齡52歲。術前均未接受過非甾體類抗炎藥治療及放、化療。標本取出后立即以10%中性甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，5μm連續切片備用。臨床與病理證實均未發現轉移，腫瘤分化程度根據Edmondson四級分級法.將HCC分為I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級。

1.2 主要試劑

Notchl抗體（鼠抗人單克隆抗體，美國Neomarker公司，clone A6），工作濃度為 1∶50；Jagged1抗體（鼠抗人單克隆抗體，美國Santa-cruz公司，sc8303），工作濃度為1∶50，SP免疫組化試劑盒購自福建邁新生物技術有限公司。

1.3 方法

標本經10%中性甲醛液固定，常規處理，石蠟包埋，連續切片厚4μm。采用免疫組化SP法：石蠟切片脫蠟至水；3%H2O2室溫孵育30min，以消除內源性過氧化物酶的活性，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min；微波抗原修復；10%正常山羊血清封閉，室溫孵育15min，傾去血清，分別滴加Notch1、Jagged1一抗工作液，4℃孵育過夜，PBS沖洗。5min×3次：滴加生物素標記的二抗，37℃孵育20～30min，PBS沖洗，5min×3次；滴加辣根酶標記鏈酶卵白素.37℃孵育 20～30min，PBS沖洗，5min×3 次；DAB顯色；自來水充分沖洗、復染、封片。實驗中同時設陽性和陰性對照。

1.4 染色結果判斷

Notch1和Jagged1陽性染色定位于胞漿。參照CARCANGIU等[2]的半定量評分方法。根據陽性細胞著色程度和陽性細胞數量判斷結果。細胞陽性著色程度按無色、淡棕黃色、棕黃色、棕褐色分別計為0、1、2、3 分，陽性細胞數量按 ＜5%、5%～35%、36%～70%、＞70%分別計為 0、1、2、3 分，然后根據兩項評分相乘之積判斷結果≤1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～5分為中度陽性（++），≥6分為強陽性（+++）。

1.5 統計學分析

采用SPSS 13.0統計軟件包進行等級資料的秩和檢驗和等級相關分析。檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 Notch1受體和配體分子Jagged1在肝癌和癌旁正常組織中的表達

免疫組化結果顯示，肝癌組織中Notch1及Jagged1分子主要表達于腫瘤細胞的胞漿（附圖）。由表1可見，Notch1受體分子和配體Jagged1分子在肝癌和癌旁正常組織中均有不同程度的表達，在肝癌和癌旁正常組織中，Notch1的陽性表達率分別為16.4%和 91.3%；Jagged1的陽性表達率分別為10.9%和85.7%，兩組間差異均有顯著性（P=0.000）。

表1 Notchl、Jaggedl蛋白在肝癌、癌旁正常肝組織中的表達

附圖 Notch1和Jagged1免疫組化檢測結果[通用型兩步（400×）]

2.2 肝癌組織中Notch1、Jagged1蛋白的表達與臨床病理特征的關系

2.2.1 肝癌組織中Notch1、Jagged1蛋白的表達與患者性別及年齡的關系

2.2.2 肝癌組織中Notch1、Jagged1蛋白的表達與病理特征的關系 表3可見，Notch1分子的表達與肝癌組織學分級、Edmondson分期及有無淋巴結轉移均無關（P＞0.05）。表4可見，Jagged1分子在肝癌不同分化級別間差異顯著，中高分化組肝癌Jagged1表達（82.9%）顯著低于低分化組（100.0%，P＜0.05）；分化程度越低，Jagged1的表達越高，兩者呈負相關（rs=-0.392，P=0.002）；不同 Edmondson 分期間Jagged1 表達差 異也顯著 ，Edmondson（I+II）期Jagged1表達（78.3%）顯著低于 Edmondson（III+IV）期（96.4%，P＜0.05）；從 Edmondson I期到 IV期，表達逐漸增高，兩者呈正相關（rs=0.276，P=0.001）；有淋巴結轉移者Jagged1的表達（97.1%）顯著高于無淋巴結轉移者（73.3%，P＜0.05），且兩者之間也呈正相關（rs=0.252，P=0.006）。

表2 肝癌中Notch1及Jagged1蛋白表達與與患者性別、年齡及腫瘤大小之間的關系

表3 肝癌組織中Notch1和Jagged1蛋白表達與病理特征之間的關系

2.2.3 肝癌組織中Notch1與Jagged1的表達的關系由表4可見，肝癌組織中Notch1與Jagged1的表達呈正相關（rs=0.247，P=0.007）。

表4 肝癌組織中Notch1與Jagged1的表達的關系

3 討論

Notch信號是細胞與細胞之間直接作用的主要信號通路之一，對多細胞生物中細胞命運的決定起關鍵作。在哺乳動物中共發現4類Notch基因，編碼4種Notch受體，分別為Notchl1-4。Notch受體是一種跨膜受體，成熟的Notch受體分子是由胞外域和跨膜區/胞內域2個亞基組成的異三聚體。Notch胞外區與其配體結合后調節細胞間的相互作用并進而激活Notch，經3次裂解后產生NICDN，此為Notch受體的活化形式。

1991年，Notch1與腫瘤的關系首先在人類T淋巴母細胞白血病中被確定[1]隨后的研究發現，染色體易位 t（7；9）（q34；q34.3） 使位于 9 號染色體上的Notch1基因斷裂，導致Notch1胞外區丟失，其胞內區獲得組成性活性而呈現致癌作用。但Notch信號與腫瘤的關系極其復雜，在不同狀況下，分別充當癌基因或抑癌基因的作用。如TONON等[2]闡述了Notch在黏液表皮樣癌中作為癌基因在信號通路中的作用，而NICOLAS等[3]則發現在鼠皮膚癌發生中，Notch1起抑癌作用而不是促癌作用。在不同組織、腫瘤發展的不同階段，Notch的作用也可能不同。ZAGOURAS等[4]實驗顯示，從正常宮頸組織到宮頸上皮內瘤變，再到早期分化好的宮頸癌，Notch1的表達量逐漸增高，其定位由胞質至胞核，而晚期宮頸癌Notch1表達水平顯著下降，提示Notch1在宮頸癌發生早期階段為促癌作用，而晚期表現為抑癌作用。COLLINS等[5]研究發現，非小細胞肺癌（NSCLC）組織中Notch1和Notch2呈高表達，在小細胞肺癌（SCLC）中卻很少能檢測到Notch1表達，Notch2也只偶有表達。Notch1信號激活對NSCLC是促進腫瘤細胞生長，對SCLC則抑制腫瘤細胞生長。

人的Notch配體包括Delta1、Delta3、Delta4、Jaggedl和Jagged2五種。Jagged1是Notch受體的主要配體之一，參與調控許多組織的生長發育，對正常造血前體細胞的維持及其增殖的調控起著重要作用。Jagged1通過與鄰近細胞表面Notch受體的胞外域結合而觸發Notch信號通路，通過HES-1，Deltex和NF-κB等轉錄因子調節靶基因的轉錄。DICKSON等[6]發現乳腺癌組織中Notch1和Jagged1表達增強，并與惡性腫瘤侵襲性增強、預后不良有顯著關系，其十年生存率及中位生存期明顯降低。配體Jagged1蛋白的表達在轉移性前列腺癌中的表達明顯高于無轉移者及前列腺良性組織，提示Jagged1與前列腺癌轉移及復發有關。

本研究顯示，Notch1蛋白在肝癌中的表達明顯高于癌旁正常組織，與CHU等[7]的研究結果相符；本研究表明肝癌組織中Jagged1蛋白表達顯著增強，且Notch1蛋白與Jagged1蛋白表達呈正相關。說明Notch1信號也參與了肝癌的致病過程。本研究還表明肝癌中Notch1及Jagged1蛋白的表達與患者性別與年齡，腫瘤的部位與大小均無關；但Jagged1蛋白的表達與大腸癌的分化程度有關，中高分化大腸癌Jagged1蛋白的表達顯著低于低分化大腸癌，且兩者呈負相關：不同Edmondson分期間Jagged1表達差異也顯著，Jagged1 表達在 Edmondson（I+II）期患者中低于Edmondsons（III+IV）期，兩者呈正相關；有淋巴結轉移者Jagged1的表達高于無淋巴結轉移者，也呈正相關關系。這些結果進一步提示Jagged1可能在肝癌的發生發展中起促進作用。因為腫瘤組織學分級、Edmondsons分期及淋巴結轉移與預后密切相關。因此，肝癌組織中Jagged1蛋白的表達可能作為預測肝癌預后的一個指標，有待進一步隨訪研究。

綜上所述，筆者發現：肝癌組織中Notch1受體及其相關配體Jagged1的蛋白表達明顯增強，且后者與肝癌分化程度、Edmondson分期及淋巴結轉移密切相關。提示Notch信號在肝癌致病過程中起促癌作用。Jagged1在促進肝癌發生發展中可能起重要作用。有待進一步進行體內和體外實驗證實。

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[3]NICOLAS M,WOLFER A,RAJ K,et a1.Notch1 functions as a tumor suppressor in mouse skin[J].Nat Genet,2003,33(3)：416-421.

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