血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β對(duì)大鼠肝纖維化影響的研究*

曹友德，范莎莎，鄧中華

（湖南省人民醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

肝纖維化是大多數(shù)感染性肝病的終末階段，目前對(duì)于其發(fā)病的機(jī)制尚未完全清楚，對(duì)于肝纖維化的治療也無(wú)好的方法。研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程起著重要作用。它通過(guò)活化肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC），促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成與沉積而致肝纖維化，是肝纖維化重要的始動(dòng)因子之一。為探討血清中TGF-β與肝纖維化的關(guān)系，本文通過(guò)研究SD大鼠肝纖維化模型，探討大鼠血清中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）與肝纖維化的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠60只，雄性，無(wú)特定病原體級(jí)（SPF），質(zhì)量（203±23.4）g，湖南省斯萊克景達(dá)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物注射

用0.9%氯化鈉注射液由哈藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)。分析純四氯化碳（CCl4）由北京鼎國(guó)生物有限公司生產(chǎn)。10%CCl4（v/v）用0.9%氯化鈉注射液與分析純CCl4按比例混合。檢測(cè)血清TGF-β含量的ELISA試劑盒由R&D公司生產(chǎn)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由上?？迫A公司生產(chǎn)，實(shí)時(shí)定量PCR試劑由Fermantas公司提供，引物由上海生工合成。

1.3 主要儀器

日本日立公司Hitachi 7600型全自動(dòng)生化儀，倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶標(biāo)儀（Bio-Rad，美國(guó)），實(shí)時(shí)定量PCR儀（ABI，美國(guó)）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物模型制備及分組 SD大鼠喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組，每組20只，分別為正常對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組和肝纖維化組。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后每周一、四正常對(duì)照組不給于任何處理正常進(jìn)食進(jìn)水喂養(yǎng)；生理鹽水對(duì)照組腹腔注射生理鹽水（用量按0.1mL/10 g體重），肝纖維化組腹腔注射10%CCl4。（用量按0.1mL/10 g體重）造模。每次腹腔注射前均測(cè)量大鼠體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量注射相應(yīng)劑量的生理鹽水和10%CCl4。造模6周后，隨即取各組大鼠各1只解剖肝臟，HE染色觀察肝臟的組織變化。

1.4.2 標(biāo)本的收集與處理 各組實(shí)驗(yàn)分別在用藥的第6周最后1次腹腔注射后4 h，登記編號(hào)，記錄狀態(tài)，稱(chēng)質(zhì)量后給予4%水合氯醛腹腔注射麻醉，下腔靜脈取血，分離血清備用。

1.4.3 生化指標(biāo)的檢測(cè) 利用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）2項(xiàng)指標(biāo)。

1.4.4 血清TGF-β的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）測(cè)定血清TGF-β的含量，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。

1.4.5 實(shí)時(shí)定量檢測(cè)肝纖維化相關(guān)基因 TRIzol提取動(dòng)物肝臟組織提取總RNA，根據(jù)上?？迫A公司PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書(shū)獲取cDNA，按照Fermants實(shí)時(shí)定量試劑盒說(shuō)明書(shū)25μL反應(yīng)體系，MaximaTMSYBR Green Master Mix：3μL，模板：cDNA 2μL，上下游引物（10 pmol/L）各：0.5μL，去離子水：21μL，總體積：25μL。反應(yīng)條件95℃ 5min預(yù)變性；94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 30 s，共 35 個(gè)循環(huán)；最后72℃5min延伸。

1.4.6 引物序列 PDGF-BB引物序列：Forward，5'-ATGACAAGACGGCACTGAAGG-3'，Reverse，5'-C AGACGGACGAGGGAAACAA-3'；CTGF 引物序列：Forward，5'-CACCCGGGTTACCAATGACAA-3'；Re verse，5'-AGCCCGGTAGGTCTTCACACTG-3'。GAPDH引物序列：Forward，5'-GACAACTTTGGCATCGTGGA-3'；Reverse，5'-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3'。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包。同一指標(biāo)的組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝纖維化模型鑒定

各組大鼠肝臟組織切片見(jiàn)圖1。HE染色結(jié)果顯示：對(duì)照組及生理鹽水對(duì)照組正常肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞索排列規(guī)則有序，肝細(xì)胞無(wú)脂肪性變。肝纖維化模型組大鼠肝組織正常結(jié)構(gòu)被破壞，肝索排列紊亂，膠原纖維大量增生，增生的膠原纖維連接形成粗大的纖維縱隔，沿肝竇伸向肝小葉連接，形成完全假小葉，肝細(xì)胞脂肪性變，變件肝細(xì)胞大于全部肝細(xì)胞比例的1/2。

圖1 各組大鼠肝臟組織HE染色（×40）

圖2 3組PDGF-BB、CTGF表達(dá)實(shí)時(shí)PCR定量曲線

2.2 各組大鼠血清ALT及AST水平，及TGF-β含量比較

由附表可見(jiàn)與正常對(duì)照組比較，生理鹽水對(duì)照組血清ALT、AST及TGF-β的含量差異無(wú)顯著性（P＞0.05）肝纖維化模型組血清ALT、AST水平較正常對(duì)照組及生理鹽水對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），肝纖維化模型組的TGF-β的含量高于正常對(duì)照組及生理鹽水對(duì)照組（P＜0.05）。

附表 各組間大鼠血清中ALT、AST和TGF-β值比較

2.3 熒光實(shí)時(shí)定量肝纖維化相關(guān)基因血小板衍生生長(zhǎng)因子BB、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)檢測(cè)

肝纖維化模型組與肝纖維化相關(guān)基因PDGFBB（platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB）、CTGF（connective tissue growth factor，CTGF）表達(dá)增強(qiáng)（圖2A），而生理鹽水組（圖2B）與正常對(duì)照組（圖2C）無(wú)表達(dá)。

3 討論

肝纖維化是指肝細(xì)胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時(shí)，肝內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生的病理過(guò)程，是各種慢性肝病發(fā)展成為肝硬化的必經(jīng)病理過(guò)程。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行不斷的探索，證實(shí)肝硬化不能完全逆轉(zhuǎn)[1-3]。因此，早期阻斷和逆轉(zhuǎn)肝纖維化是防治肝硬化的關(guān)鍵。國(guó)內(nèi)外近年的研究證實(shí)肝纖維化的病理學(xué)基礎(chǔ)為細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成增加，降解減少，導(dǎo)致膠原過(guò)度沉積[4-5]。肝星狀細(xì)胞（HSC）是肝臟ECM的主要來(lái)源，HSC的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，受到多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，例如TGF-β、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF-BB）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）、白細(xì)胞介素 1（interleukin 1，IL-1）等。

本研究主要是通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯哭D(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β在肝纖維化過(guò)程中的作用及其機(jī)制。TGF-β是一類(lèi)具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞分化的一類(lèi)因子，它廣泛存在于動(dòng)物正常組織細(xì)胞當(dāng)中，具有促進(jìn)胚胎發(fā)育，免疫調(diào)節(jié)，抑制生長(zhǎng)，創(chuàng)傷修復(fù)，促進(jìn)血管生成和促進(jìn)ECM沉積等多種生物學(xué)功能，人類(lèi)TGF-β 主要有 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β33 種。在人體內(nèi)，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角化細(xì)胞、顆粒層細(xì)胞、白血病細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞等都能產(chǎn)生TGF-β。而啟動(dòng)肝纖維化的TGF-β則是由Kupffer細(xì)胞、造血干細(xì)胞以及肝竇周細(xì)胞等肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)大鼠肝纖維化模型組的TGF-β水平較正常對(duì)照組明顯增高。正常情況下體內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生的TGF-β都是以無(wú)活性形式存在的，又稱(chēng)之為潛在的TGF-β。同時(shí)它與體內(nèi)潛在的相關(guān)肽（LAP）以共價(jià)鍵的形式相結(jié)合，這種狀態(tài)下的TGF-β是不能與受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用。各種原因引起的肝臟疾病導(dǎo)致肝臟處于炎癥狀態(tài)，此時(shí)肝細(xì)胞破裂壞死以及過(guò)氧化損傷誘導(dǎo)TGF-β由潛伏狀態(tài)向活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變，從而導(dǎo)致血清中參與ELISA反應(yīng)的活化的TGF-β含量增加，激活的TGF-β與受體結(jié)合，通過(guò)Smad信號(hào)通路作用于肝星狀細(xì)胞（HSC）、Kupffer細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞。HGF-β在促進(jìn)HSC活化、增殖，向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的同時(shí)，還刺激活化的HSC合成和分泌大量的ECM以及EMC蛋白水解酶抑制劑，抑制ECM的降解，增加EMC在組織中的沉積，它的作用結(jié)果就是肝臟中的EMC沉積不斷增多，最終導(dǎo)致肝纖維化的形成[7-9]。TGF-β是最為重要是啟動(dòng)鄰近靜息態(tài)HSC激活和轉(zhuǎn)化的初始信號(hào)之一。

本研究還顯示實(shí)驗(yàn)性肝纖維化模型組血小板衍生生長(zhǎng)因子BB（PDGF-BB），結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）基因表達(dá)水平也較正常對(duì)照組明顯增高。這與國(guó)內(nèi)外的最新報(bào)道結(jié)果一致。近年國(guó)外有報(bào)道[10-13]TGF-β與血小板衍生生長(zhǎng)因子BB（PDGF-BB）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）存在相關(guān)性。其原因是因?yàn)镃TGF基因的啟動(dòng)序列中包含有TGF-β的順式作用元件[14]。因此，TGF-β高表達(dá)的同時(shí)也可介導(dǎo)CTGF表達(dá)上調(diào)，從而進(jìn)一步促進(jìn)EMC的沉積。THIERINGER等[15]研究發(fā)現(xiàn)PDGF通過(guò)上調(diào)TGF-β之后激活HSC，從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。

另外，有研究顯示，血清TGF-β的含量與肝纖維化的程度有關(guān)[16-17]，臨床上可以通過(guò)檢測(cè)血清TGF-β的水平來(lái)了解肝纖維化的程度。肝纖維化是慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段。因此，檢測(cè)血清中TGF-β也可能是診斷早期肝硬化的一個(gè)良好指標(biāo)[18]具有檢查方便的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也減輕了病理檢查帶給患者的痛苦。

本研究證實(shí)在大鼠肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中TGF-β起著較為關(guān)鍵的作用，同時(shí)其關(guān)鍵作用與血小板衍生生長(zhǎng)因子BB（PDGF-BB）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）有關(guān)。

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