異氟烷麻醉后低體溫對大鼠海馬的影響*

譚文斐，田阿勇，王俊科，曹學照，馬 虹

（中國醫(yī)科大學第一醫(yī)院 麻醉科，遼寧 沈陽 110001）

Tau蛋白是一種具有生理功能的可溶性蛋白，能夠與微管蛋白結(jié)合，在神經(jīng)元及軸突的生長過程中起著重要作用[1]。在正常海馬記憶神經(jīng)元形成過程中，tau蛋白至關重要，而在病理改變中，高度磷酸化的tau蛋白起到?jīng)Q定性的作用[2]。當大鼠暴露于應激反應，能夠誘發(fā)外周和中樞炎性因子例如，白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的釋放[3]。但是，有關圍術期低體溫引起的海馬的tau蛋白和炎性因子的影響卻知之甚少。全身麻醉藥能夠明顯地損害正常的體溫調(diào)節(jié)，導致圍術期低體溫[4]。圍術期由麻醉帶來的低體溫對大多數(shù)病人是有害的[5]。低體溫雖然沒有引起明顯的神經(jīng)損害，但是可能帶來認知功能障礙。因此，本研究旨在探討暴露于臨床相關濃度的異氟烷是否導致tau蛋白高度磷酸化以及炎性因子表達的增加。

1 材料和方法

1.1 動物及麻醉方法

135只雄性成年SD大鼠購于中國醫(yī)科大學動物實驗中心，6月齡，體重 350～400 g，動物在22～23℃環(huán)境中自由活動，12：12 h日夜循環(huán)，自由進食水。大鼠吸入異氟烷（百特，美國）麻醉誘導后氣管插管，機械通氣維持異氟烷濃度為1.5%，潮氣量2.5mL，呼吸頻率65～70次/min，混合50%氧氣通氣2 h，麻醉期間暴露于室溫或給予體溫保護。期間監(jiān)測大鼠心電圖及直腸溫。預實驗結(jié)果顯示本實驗方法對心肺功能影響甚微（反映于正常的血氣分析）。大鼠隨機分為3組：健康對照組（group A；n=15）無任何干預措施。麻醉保溫組（group B；n=60），大鼠異氟烷麻醉后利用加溫墊保持體溫在36.0～37.0℃。麻醉低體溫組（group C；n=60），大鼠麻醉后暴露于22℃室溫。麻醉后大鼠自然蘇醒分籠飼養(yǎng)。B，C組大鼠分別于麻醉后2 h即刻、麻醉后1、3、7 d（15只/時點）處死，迅速取出海馬置于-70°C液氮保存，標記為 B0、B1、B3、B7、C0、C1、C3 和 C7。

1.2 蛋白印跡分析

海馬組織用溶解液（5 mM Tris-HCl，1mM phenylmethylsulfonyl fluoride，150mM NaCl，1%NP-40，0.5%Na deoxycholate，0.1%SDS，and protease and phosphatase inhibitors；pH 7.5） 勻漿處理后，以12000 g、4℃條件離心15min。蛋白提取物置入加樣緩沖液（10%SDS，0.1M Tris pH 8.0，50 mM DTT，3 mM EDTA，0.001%bromphenol blue），100℃煮沸5min，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜。硝酸纖維濾膜 5%脫脂奶粉的TBST（0.1%Tween 20，20mM Tris-HCl，137 mM NaCl，pH 7.6） 中封閉 2 h 后，分別與一抗兔抗鼠 Tau（phosphor-Thr205）（1∶500，Signalway Antibody，美國），兔抗鼠Tau[（phosphor-Ser396）（1∶500，Signalway Antibody，美國）]及兔抗鼠 Total tau（1∶500，Signalway Antibody，美國）4℃過夜。其后，膜與辣根過氧化物酶結(jié)合二抗室溫孵育2 h。最后膜與ECL系統(tǒng)曝光，成像。以每條帶的光密度值（IDV，Integrated Density Value）做為條帶的強度指標，以β-actin的IDV值做為內(nèi)參照，采用目標條帶IDV與相應的β-actin IDV比值做為指標進行統(tǒng)計學分析[6]。

1.3 磷酸酶活性分析

利用絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶測定系統(tǒng)進行蛋白磷酸酶2A（PP2A）活性測定[6]。大鼠斷頸處死后迅速取海馬，置入磷酸酶樣本緩沖液勻漿，去除顆粒物及內(nèi)源性磷酸鹽。取2.0μL樣本溶液，在PP2A緩沖液中孵育10min，可以測定化學合成硫酸肽的釋放。磷酸鹽釋放量可以通過630 nm時樣本吸光率測定。通過比較各組與對照組吸光率比值判斷PP2A活性變化。

1.4 實時定量PCR分析IL-1β m RNA和TNF-αmRNA

利用Trizol試劑將總RNA從海馬勻漿液中分離。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaRaKa，中國）說明合成cDNA。RNA樣品與gDNA混合42℃孵育2min。逆轉(zhuǎn)錄緩沖液和引物混合后加入樣品42℃孵育15 min，然后95℃孵育3min。利用Applied Biosystems（Foster，美國）系統(tǒng)進行實時定量PCR。大鼠IL-1β引物：5'-ATCCCAAACAATACCCA-3'，和 5'-CAACTATGTCCCGACCA-3'；TNF-α 引物：5'-CCACGCTC TTCTGTCTACTG-3'和5'-GCTACGGGCTTGTCACT C-3'；3- 磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物：5'-GCA AGTTCAACGGCACA-3'和5'-CATTTGATGTTAGCG GGAT-3'。ABI PRISM 7500HT檢測系統(tǒng)進行熒光測定，以GAPDH為內(nèi)參照，對循環(huán)數(shù)（threshold cycle）Ct值計算后進行比較[6]。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 麻醉誘發(fā)低體溫

麻醉后可以誘發(fā)低體溫，大鼠直腸溫度分別為麻醉即刻，（37.0±1.2）℃；麻醉后 30min，（34.0±1.3）℃；麻醉后 60min，（30.0±1.1）℃；麻醉后 120 min，（27.0±1.2）℃。麻醉復蘇后所有動物體溫均恢復正常。

2.2 低體溫調(diào)節(jié)麻醉誘導的tau蛋白高度磷酸化

為了檢測室溫下暴露于異氟烷對大鼠腦內(nèi)tau蛋白磷酸化的影響，本組測試了海馬內(nèi)tau蛋白兩個位點的磷酸化程度。Thr205位點和Ser396位點與對照組比較分別增加了10倍和2.9倍，但total tau沒有顯著變化（表1）。當麻醉鼠進行保溫處理時，體溫持續(xù)在37℃，磷酸化位點恢復到對照組相似水平，total tau仍然沒有變化。這些結(jié)果提示，麻醉對于tau蛋白磷酸化的影響并非麻醉本身的作用，而是受低體溫調(diào)節(jié)。

2.3 麻醉引起的低體溫抑制PP2A

基于先前研究的結(jié)果[6]，麻醉期間的tau蛋白磷酸化可以歸結(jié)為低體溫對于絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶活性的直接抑制作用。本組利用PP2A測試試劑系統(tǒng)對于這一內(nèi)源性脫磷酸化作用進行測試。麻醉保溫組和對照組PP2A活性差異無顯著性；麻醉低體溫組和對照組比較，PP2A活性抑制約45%（表2）。這些數(shù)據(jù)說明，麻醉期間的tau蛋白磷酸化是低體溫對于磷酸酶活性直接抑制的結(jié)果，因為麻醉低體溫組與對照組改變僅僅是因為體溫發(fā)生了改變。

2.4 麻醉引起的低體溫誘發(fā)炎性反應

與對照組比較，麻醉期間保溫并不增加IL-1β mRNA和TNF-α mRNA的表達。但是，麻醉低體溫組在麻醉后2 h，麻醉后1，3 d，IL-1βmRNA表達分別增加 12.7倍（P＜0.01），17.9倍（P＜0.01）和 2.3倍（P＜0.05）。麻醉期間低體溫組在麻醉后1、3 d，TNF-αmRNA表達同樣增加2.0倍和1.6倍（P＜0.05）。見表 2。

表1 麻醉后低體溫誘導的tau蛋白高度磷酸化（%，，n=5）

表1 麻醉后低體溫誘導的tau蛋白高度磷酸化（%，，n=5）

注：1）與對照組比較，差異有顯著性，P＜0.05；2）與對照組比較，差異無顯著性，P＜0.01

組別 Total tau phosphor-Thr205 phosphor-Ser396 A 1.08±0.20 1.10±0.20 0.92±0.20 B0 1.08±0.20 0.96±0.10 1.06±0.20 C0 1.14±0.10 12.26±0.802） 4.16±0.201）B1 0.94±0.20 1.18±0.20 0.98±0.20 B3 1.16±0.10 1.00±0.30 0.84±0.10 B7 0.96±0.30 1.14±0.20 1.18±0.10 C1 1.14±0.10 1.08±0.10 1.02±0.20 C3 1.07±0.10 1.04±0.20 0.84±0.10 C7 1.2±0.10 1.10±0.30 0.86±0.10

圖1 麻醉后低體溫誘導的tau蛋白高度磷酸化（%，，n=5）

圖2 Real-time PCR反應溶解曲線及擴增曲線

表2 麻醉后低體溫對蛋白磷酸酶活性和炎性因子的影響（%，，n=5）

表2 麻醉后低體溫對蛋白磷酸酶活性和炎性因子的影響（%，，n=5）

注：1）與對照組比較，差異有顯著性，P＜0.05；2）與對照組比較，差異無顯著性，P＜0.01

組別 PP2A IL-1βmRNA TNF-αmRNA A 1.03±0.06 1.01±0.30 1.02±0.20 B0 1.13±0.06 1.30±0.10 1.34±0.30 C0 0.5±0.031） 12.73±0.602） 1.28±0.40 B1 0.93±0.15 1.26±0.40 1.34±0.30 B3 1.13±0.06 1.44±0.40 1.26±0.30 B7 0.97±0.21 1.40±0.10 1.24±0.20 C1 0.93±0.15 17.86±0.572） 2.02±0.201）C3 1.06±0.15 2.26±0.201） 1.66±0.31 C7 1.00±0.20 1.14±0.20 1.32±0.40

3 討論

本研究探討了異氟烷麻醉大鼠體溫的變化，海馬內(nèi)tau蛋白的磷酸化以及炎性因子的變化。結(jié)果提示1.5%的異氟烷麻醉后可以導致持久的低體溫，抑制PP2A，誘發(fā)tau蛋白高度磷酸化。麻醉期間進行體溫保護可以保持磷酸化tau蛋白在正常水平。麻醉期間低體溫可以增加炎性因子IL-1βmRNA和TNF-αmRNA的表達。

已有研究表明異氟烷對于心臟的保護作用[7-8]，還有研究提示，異氟烷麻醉鼠比對照組學習能力更強，體外測試長時程電位提高，海馬神經(jīng)元NMDA受體NR2B亞單位選擇性上調(diào)[9]。異氟烷能夠提高生后60 d鼠空間參考記憶，但在生后7 d的鼠面對恐懼環(huán)境和空間參考記憶，會引起海馬相關性的持久損害[10]。最近的幾項研究更加關注異氟烷麻醉對于神經(jīng)元改變，尤其是對于細胞增殖的影響。新生鼠異氟烷麻醉后立即引起腦細胞的退行性變，但是，對于成年鼠并未觀察到自主運動、，空間記憶學習能力的改變，以及神經(jīng)元密度的變化[11]。對于幼鼠，異氟烷麻醉后并未觀察到海馬細胞的增殖，麻醉藥物對于細胞抑制的機制并不明確[12]。本研究的重點也并非異氟烷對于海馬功能的直接影響，而是關注異氟烷麻醉后誘發(fā)的低體溫引起的海馬內(nèi)蛋白和炎性因子的變化，而這些變化有可能為尋找麻醉后認知功能變化提供線索。

針對于創(chuàng)傷、危重病人的恢復以及外科操作，低體溫是保護大腦的常用手段。當伴隨有低氧，缺血，炎癥及外傷時，低體溫治療有其特異的效果。尤其在心血管手術中，深低體溫對大腦確有獨特的保護作用。但是，麻醉后誘發(fā)的低體溫對于大腦皮層功能潛在的損害一直是有爭議的[13]。

總之，本研究提示，臨床相關劑量的異氟烷麻醉后引起tau蛋白磷酸化水平增加。這種盡管是可逆性的磷酸化的tau蛋白，能夠增加tau不溶性，誘發(fā)其聚集，導致tau蛋白從微管解離。而且，神經(jīng)纖維網(wǎng)及神經(jīng)元細胞內(nèi)磷酸化tau蛋白水平增加。所有這些tau病變是海馬內(nèi)學習記憶改變的病理學基礎。而且，IL-1在皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)液中可以加速神經(jīng)纖維纏結(jié)，說明其在tau病理中至關重要[14]。這些發(fā)現(xiàn)提示實驗動物進行體溫保護，可避免海馬內(nèi)蛋白磷酸化和炎性因子表達增加。而且，麻醉誘發(fā)低體溫對于術后認知功能障礙的影響值得深入研究。

[1]WEINGARTEN MD,LOCKWOOD AH,HWO SY,et al.A protein factor essential for microtubule assembly[J].Proc Natl Acad Sci USA,1975,72(5)：1858-1862.

[2]BOEKHOOM K,TERWEL D,BIEMANS B,et al.Improved long-term potentiation and memory in young tau-P301L transgenic mice before onset of hyperphosphorylation and tauopathy[J].J Neurosci,2006,26(13)：3514-3523.

[3]CHEN J,BUCHANAN JB,SPARKMAN NL,et al.Neuroinflammation and disruption in working memory in aged mice after acute stimulation of the peripheral innate immune system[J].Brain Behav Immun,2008,22(3)：301-311.

[4]TAGUCHI A,KURZ A.Thermal management of the patient：where does the patient lose and/or gain temperature[J].Curr Opin Anaesthesiol,2005,18(6)：632-639.

[5]SESSLER DI.Perioperative heat balance[J].Anesthesiology,2000,92(2)：578-596.

[6]PLANEL E,RICHTER KE,NOLAN CE,et al.Anesthesia leads to tau hyperphosphorylation through inhibition of phosphatase activity by hypothermia[J].J Neurosci,2007,27(12)：3090-3097.

[7]覃 軍,徐道妙,郭曲練,等.異氟醚預處理對豬心肺聯(lián)合移植術后肺循環(huán)的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2005,15(3)：385-387.

[7]QIN J,XU DM,GUO QL,et al.Effect of isoflurane preconditioning on pulmonary circulation of swine after combined transplantation of heart and lung [J].China Journal of Modern Medicine,2005,15(3)：385-387.Chinese

[8]沈 潔,陳衛(wèi)民.一氧化氮在異氟烷預處理腦保護中的作用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2007,17(21)：2593-2596.

[8]SHEN J,CHEN WM.Effect of nitric oxide on isoflurane preconditioning against brain ischemia-reperfusion[J].China Journal of Modern Medicine,2007,17(21)：2593-2596.Chinese

[9]RAMMES G,STARKER LK,HASENEDER R,et al.Isoflurane anaesthesia reversibly improves cognitive function and long-term potentiation (LTP)via an up-regulation in NMDA receptor 2B subunit expression[J].Neuropharmacology,2009,56(3)：626-636.

[10]STRATMANN G,SALL JW,MAY LD,et al.Isoflurane differentially affects neurogenesis and long-term neurocognitive function in 60-day-old and 7-day-old rats[J].Anesthesiology,2009,110(4)：834-848.

[11]LOEPKE AW,ISTAPHANOUS GK,3rd MJJ,et al.The effects of neonatal isoflurane exposure in mice on brain cell viability,adult behavior,learning,and memory[J].Anesth Analg,2009,108(1)：90-104.

[12]TUNG A,HERRERA S,FORMAL CA,et al.The effect of prolonged anesthesia with isoflurane,propofol,dexmedetomidine,or ketamine on neural cell proliferation in the adult rat[J].Anesth Analg,2008,106(6)：1772-1777.

[13]DELEON SY,THOMAS C,ROUGHNEEN PT,et al.Experimental evidence of cerebral injury from profound hypothermia during cardiopulmonary bypass[J].Pediatr Cardiol,1998,19(5)：398-403.

[14]LI Y,LIU L,BARGER SW,et al.Interleukin-1 mediates pathological effects of microglia on tau phosphorylation and on synaptophysin synthesis in cortical neurons through a p38-MAPK pathway[J].J Neurosci,2003,23(5)：1605-1611.