心痛方對心肌缺血模型大鼠MPO活性及PS表達的干預作用

匡秀青，范金茹，姜益宏，陳 彤，楊金怡，那奕文

（湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙410007）

冠心病（CHD）是冠狀動脈粥樣硬化使血管腔阻塞，導致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病，是動脈粥樣硬化（AS）最常見的疾病。就其發病機制而言，有氧自由基損傷、鈣超載、炎癥反應和血管內皮紊亂等，其中炎癥反應機制受到日益重視。越來越多的證據表明，局部和全身的炎癥在冠心病的發生發展中起重要作用[1]。冠心病急性心肌缺血是一個急性炎癥反應過程，中性粒細胞是缺血區最早出現的效應白細胞，于缺血后30 min 開始浸潤，24～48 h達高峰[2]，髓過氧化物酶(MPO)是一種血色素蛋白，它存于嗜中性多核細胞的嗜天青顆粒和巨嗜細胞中，MPO 活性是評價中性粒細胞浸潤程度的可靠指標[3]。PS 屬于細胞黏附分子中的選擇素家族，其通過介導血小板-白細胞相互反應，參與炎癥反應及血栓形成，在冠心病發病中起重要作用。心痛方是臨床驗方，研究表明心痛方治療冠心病心絞痛療效確切，并能顯著降低冠心病患者的炎癥指標，干預血小板、白細胞聚集及浸潤[4]。本研究通過觀察心痛方對心肌缺血大鼠模型心肌梗死面積、MPO 活性、PS 表達的影響，現將實驗方法及結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康SD 大鼠，雄性，清潔級，體質量180～200 g，鼠齡8～10 w，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號 SCXK （湘）-2009-0004。

1.1.2 藥物 心痛方（柴胡，郁金，九香蟲，瓜蔞，桃仁，白芥子）購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，在湖南中醫藥大學心血管實驗室統一煎制成濃縮湯劑（含生藥0.108 g/mL）；單硝酸異山梨酯（欣康，20 mg/片，批號00958453）由魯南貝特制藥有限公司提供。

1.1.3 試劑 MPO 試劑盒由南京建成生物試劑研究所提供，PS 抗體、PBS 緩沖液等由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.1.4 儀器 DH-140 動物人工呼吸機 （浙江醫科大學儀器實驗廠），RM6280 多導生理信號采集系統（成都儀器廠），UV-754 紫外可見分光光度計（上海第三分析儀器廠），MIAS 醫學圖像分析系統 （北航公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 大鼠80 只，按體質量分層，再按隨機數字表隨機分組。分為A 組（假手術組）、B 組（模型組）、C 組（心痛方組）、D 組（欣康組），每組20只。

1.2.2 動物造模 參考文獻方法[5-6]，采用結扎冠脈左前降支造成心肌缺血模型。穿線、或結扎后即刻記錄心電圖，以心臟左室前壁呈紫紺或Ⅱ導聯ST 段弓背向上抬高大于0.1 mv 并持續0.5 h 以上為結扎成功標志 （S-T 段無改變者淘汰），3 h 后處死動物。

1.2.3 給藥方法 均采用灌胃法給藥，劑量均按60 kg 人體表面積換算，藥物濃度為1 mL/100 g 灌胃容量配制[7]。常規飼養1 周后，心痛方組按1.08 g/kg劑量給藥、欣康組按0.87 mg/kg 分別用配好的藥液灌胃，模型組和假手術組分別給予灌服同等體積生理鹽水，連續7 d，每天1 次，于第7 天灌胃30 min后進行實驗。

1.2.4 心肌梗死面積測定 處死后摘取心臟，切片，NBT 染色液中37 ℃溫孵15 min，梗死心肌不著色，正常心肌染成藍色。數碼相機拍攝心肌切片圖像，采用圖像分析儀分別測量心肌梗死面積 （心肌梗死部分占心肌橫斷面面積的百分比）。

1.2.5 心肌組織MPO 活性測定 取心肌組織4 ℃生理鹽水洗凈，稱取100 mg 心肌組織置于試管中，加入預冷試劑二勻漿介質，在冰浴下用高速攪拌分散劑磨成1∶20（W/V）勻漿，取0.9 mL 5%組織勻漿，分別經37 ℃水浴15、30 min 及60 ℃水浴10 min，取出后立即在460 nm 處調光徑1 cm，蒸餾水調零，分光度測定各管OD 值，最后按以下公式計算出MPO 活性，計算公式為：

MPO 單位/克濕重=(測定管OD 值-對照管OD值)／[11.3×取樣量(g)]。

1.2.6 心肌組織PS 表達測定 取各組缺血區域心肌組織切片，采用免疫組化SABC 法染色封片鏡檢。黃褐色或棕色顆粒為陽性產物，在顯微鏡下用醫學彩色圖像分析系統測量陽性反應物的平均光密度（AOD）。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 心痛方對各組大鼠心肌梗死面積的影響

心痛方組、欣康組、模型組可見較明顯心肌梗死，其中模型組最為顯著，梗死面積最大，假手術組未見梗死，3 組心肌梗死面積與假手術組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01），結果表明造模成功。心痛方組與模型組比較，梗死面積較小，差異有統計學意義 （P＜0.01），說明心痛方能縮小心肌梗死面積；欣康組與模型組比較，梗死面積較小，差異有統計學意義（P＜0.05）；心痛方組與欣康組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），說明心痛方和欣康均能縮小大鼠心肌梗死面積。結果見表1。

表1 各組大鼠心肌缺血模型心肌梗死面積比較 （n=8，±s）

表1 各組大鼠心肌缺血模型心肌梗死面積比較 （n=8，±s）

注：與假手術組比較*P＜0.01；與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01。

組 別假手術組模 型 組心痛方組欣 康 組藥物劑量（g/kg）— —1.08 8.7×10-4心肌梗死面積（%）0 29.48±8.11*20.21±5.39*△△22.94±7.68*△

2.2 心痛方對心肌缺血大鼠模型MPO 活性的影響

心痛方組、欣康組、模型組與假手術組比，MPO活性明顯升高，其中模型組升高最顯著，說明大鼠心肌急性缺血時MPO 活性升高，表明髓過氧化物酶在大鼠急性心肌缺血中起到一定的促進作用，差異有統計學意義（P＜0.01）；心痛方組、欣康組與模型組比較，MPO 活性明顯降低，差異有統計學意義 （P＜0.01，P＜0.05），心痛方組與欣康組比較，MPO 活性降低更明顯，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05）；說明心痛方、欣康能抑制心肌MPO 活性，而心痛方作用更強。結果見表2。

2.3 心痛方對心肌缺血大鼠模型PS 表達的影響

與模型組比較，心痛方組、欣康組缺血心肌PS表達均明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.01)，說明心痛方、欣康能抑制PS 在缺血心肌中的表達；心痛方組與欣康組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表2。

表2 各組大鼠心肌缺血模型心肌MPO 活性、PS 表達比較 （n=8，±s）

表2 各組大鼠心肌缺血模型心肌MPO 活性、PS 表達比較 （n=8，±s）

注：與假手術組比較*P＜0.01；與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01。

組 別假手術組模 型 組心痛方組欣 康 組PS 表達（AOD）0.09±0.03 0.51±0.04*0.19±0.03*△0.20±0.03*△藥物劑量(g/kg)— —1.08 8.7×10-4 MPO 活性（U/g）0.31±0.09 3.23±0.72*1.31±0.49*△△2.04±0.80*△

3 討論

心痛方主要由柴胡、瓜蔞、白芥子、桃仁、郁金、九香蟲等藥組成，是依據全國名老中醫王行寬教授“雜病治肝”理論演化而來，以疏肝豁痰化瘀法立方。方中柴胡為君藥，疏肝理氣，取“氣行則血行”之意，使“肝氣通則心氣和”。瓜蔞、白芥子、桃仁為臣藥，三者合用，豁痰化瘀、行氣止痛以治標實；栝蔞性寒，既可防白芥子辛溫傷陰之弊，又防治肝郁化火之勢；郁金為佐，佐君藥疏肝解郁，助臣藥行氣活血化瘀；九香蟲為使，走竄絡脈，理氣止痛而不傷胃，并能理肝胃之氣、行膈脘之滯以助脾胃之健運，以絕生痰之源。故總方功效以疏肝解郁理氣為重，化痰與祛瘀并舉，冀脈絡通暢，氣血安和，常用于治療肝郁痰瘀氣滯證冠心病心絞痛患者。

本研究結果表明：心痛方能縮小急性心肌缺血大鼠心肌梗死面積；抑制心梗心肌MPO 活性及PS表達，在抑制MPO 活性方面心痛方組優于欣康組。

MPO 是心肌損傷過程中中性粒細胞浸潤的特異性指標，吳氏等觀察大鼠心肌缺血再灌注模型中中性粒細胞與心肌損傷程度的相關性，表明心肌損傷的程度與心肌內中性粒細胞浸潤數呈正相關，證明聚集在缺血區的中性粒細胞被激活，產生大量的氧自由基，對組織細胞產生損傷作用[8]。

PS 在血栓形成過程中起始動作用，放大炎癥反應，并通過與P 選擇素糖蛋白配體相互作用誘導促凝血顆粒產生，使機體進入血栓前狀態，從而參與冠狀動脈粥樣硬化的形成和發展，與動脈粥樣斑塊的形成及其穩定性密切相關[9]。通過干預中性粒細胞的浸潤、降低PS表達及其黏附作用可能是心痛方治療缺血性心肌病變的作用機制之一。

[1]Crea F，Biasucci L M，Buffon A，et al.Role of inflammation in the pathogenesis of unstable coronary artert disease[J].Am J Cardiol，1997，80(5):10-16.

[2]Calvert J W，LeferD J.Statin therapy and myocardialno-reflow Br[J].J Pharmacol，2006，14(9)：229-231.

[3]Nahrendorf M，Sosnovik D，Chen J W，et al.Activatable magnetic resonance imaging agent reports myeloperoxidase activity in healin g infarcts and noninvasively detects theantiin flammatory effects of atorvastatin on ischemia-reperfusion injury[J].Circulation，2008，117（9）：1 153-1 160.

[4]范金茹，劉鳳英，黃 佳，等.疏肝化瘀豁痰法治療不穩定型心絞痛療效及對血小板-白細胞相互作用的干預觀察[J].中國中醫急癥，2008，17(12)：1 653-1 655.

[5]劉尊齊，崔連群，蓋玉生，等.大鼠急性心肌梗死模型的制備[J].基礎醫學與臨床，2007，27(9)：1 059-1 060.

[6]李開宇，田 海，孫 露，等.標準化大鼠心肌梗死模型的制作[J].哈爾濱醫科大學學報，2007，41（6）：531-534.

[7]賀石林，王 鍵，王凈凈.中醫科研設計與統計學[M].長沙：湖南科學技術出版社，2007：48-49.

[8]吳志峰，余伯陽，朱丹妮，等.大鼠心肌缺血再灌注模型中中性粒細胞與心肌損傷程度的相關性研究 [J].中國藥科大學學報，2002，33(3)：231-233.

[9]Juan Carlos Kaski，Daniel J.Fernández-Bergés，Luciano Consuegra-Sánchez，et al.A comparative study of biomarkers for risk prediction in acute coronary syndrome—Results of the SIESTA(Systemic Inflammation Evaluation in non -ST -elevation Acute coronary syndrome) study [J].Atherosclerosis，2010，212（2）：636-643.