陽和湯對裸鼠移植性乳腺癌骨轉移模型作用機制的探討

田 莎，王云丹，黃立中，田雪飛，許利純，伍參榮，彭吉勇

（1.湖南中醫藥大學中西醫結合學院，湖南 長沙410208；2.長沙市中醫院，湖南 長沙410100）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，而骨轉移又是乳腺癌常見的并發癥，其臨床主要表現為進行性骨痛、骨折、功能障礙、脊索及神經根受壓、貧血、高鈣血癥，嚴重影響患者的生活質量，危及生命[1-2]。黃立中教授運用陽和湯加味治療骨轉移癌疼痛取得較好療效[3-4]。本實驗探討名方陽和湯對裸鼠移植性乳腺癌骨轉移模型的作用，以及對模型鼠血清甲狀旁腺激素相關蛋白 （PTHrP）、NF-KB 配體的受體（RANKL）、骨保護素（OPG）含量的影響，揭示陽和湯體內抗癌作用的分子機制，為臨床治療乳腺癌骨轉移提供科學的理論依據。現將實驗方法及結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 BALB/c 6～8 周齡裸小鼠，SPF 級，體質量18～22 g，雌性，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK（湘）2009-2004。

1.1.2 藥物 陽和湯由熟地黃30 g、鹿角膠9 g、肉桂3 g、炮姜炭2 g、白芥子6 g、麻黃2 g、生甘草3 g 組成。購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科，將藥物制成高劑量水煎液 （1 mL 藥液中含1.17 g 生藥）、低劑量水煎液（1 mL 藥液中含0.39 g生藥），密封備用。唑來磷酸，正大天晴藥業，規格4 mg／5 mL，批號0908272。

1.1.3 瘤株 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231，購于中南大學湘雅醫學院現代實驗中心細胞庫。

1.1.4 試劑PTHrP ELISA kit，批號：E0900100226；RANKL ELISA kit，批號 ：E0900100101；OPG ELISA kit，批號：E0900613；均購自長沙市佳和生物科技有限責任公司(美國INVITROGEN 公司生產)。

1.1.5 儀器 超凈工作臺：SW-CJ-1CV，蘇凈安泰公司；CO2培養箱：SHEL-LAB，美國Hitachi；酶標儀：奧地利TECAN；臺式離心機：TDZ5-40，長沙天創儀器公司；恒溫水浴箱：GG112-10B，上海醫療器械廠；恒溫干燥箱：101B-2，上海亞明公司；自動酶標儀：奧地利TECAN；37 ℃恒溫箱：GG112-10B，上海醫療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將成瘤后的裸鼠移植性乳腺癌骨轉移模型隨機分為4 組：陽和湯高劑量組、陽和湯低劑量組、唑來磷酸組、模型組，每組8 只。另取8 只裸鼠股骨注射生理鹽水（其他手術方法同“1.2.2”）設為假手術組。

1.2.2 動物造模 裸鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg） 麻醉后，75%乙醇消毒裸鼠皮膚，1 mL 注射器抽取2×107個/mL 人乳腺癌細胞懸液0.08 mL（約含1.6×106個乳腺癌細胞），從股骨遠端進針，平行經皮下，至股骨近端骨質疏松處刺透骨皮質，然后將針尖插入骨干內，緩慢推注細胞懸液（0.08 mL/只），接種完成。

1.2.3 給藥方法 陽和湯高、低劑量組：每天灌胃陽和湯23.40 g/（kg·d）（相當于陽和湯臨床劑量3 倍）、7.80 g/（kg·d）（相當于陽和湯臨床劑量），連續給藥20 d；唑來磷酸組：取濃度為3 μg/mL 唑來膦酸稀釋液腹腔注射，按30 μg/kg。陽和湯用藥開始日設為第1 天，第5、7、9、12、14、16、19 天，每天每只1 次[5]；模型組、假手術組：取生理鹽水0.4 mL 灌胃，每天每只1 次，連續給藥20 d。給藥劑量均按60 kg 成年人體表面積換算。

1.2.4 腫瘤大小 造模術后第5、10、15、20、25 天用游標卡尺體外測量骨轉移癌灶的長徑 （a） 及短徑（b），按公式V（mm3）=ab2π/6 計算骨轉移癌的體積。根據腫瘤體積的變化繪制各組的骨轉移癌生長曲線。

1.2.5 抑瘤率 公式：抑瘤率=（模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%，計算腫瘤的生長抑制率。

1.2.6 指標測定 采用ELISA 法檢測各組裸鼠血清中相關調節因子PTHrP、RANKL、OPG 含量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 裸鼠移植人乳腺癌骨轉移模型的復制

股骨接種人乳腺癌細胞5 d 后32 只裸鼠股骨接種處陸續出現可觸及的結節。實驗結束后，種瘤處組織的HE 染色切片置于光鏡下觀察，均發現骨組織完全破壞，被癌組織代替。證實乳腺癌骨轉移模型復制成功（見圖1）。

圖1 接種乳腺癌細胞25 d 后，裸鼠接種處組織形態（HE 染色×200）

2.2 陽和湯對各組裸鼠骨轉移癌生長的影響

根據各組裸鼠骨轉移癌的生長情況繪制生長曲線（見圖2），與模型組比，給藥各組對骨轉移癌生長均產生不同程度的抑制作用。其中陽和湯高劑量組和唑來磷酸組骨轉移癌生長緩慢，抑制作用優于陽和湯低劑量組。

圖2 各組裸鼠骨轉移癌生長曲線

2.3 陽和湯對各組裸鼠移植人乳腺癌骨轉移瘤抑瘤率的影響

結果顯示唑來磷酸組、陽和湯高、低劑量組的骨轉移癌抑制率分別為50.61%、45.05%、32.42%。陽和湯高、低劑量組、唑來磷酸組的骨轉移瘤質量與模型組相比，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 陽和湯對各組裸鼠移植人乳腺癌骨轉移瘤質量的影響（±s，n=8）

表1 陽和湯對各組裸鼠移植人乳腺癌骨轉移瘤質量的影響（±s，n=8）

注：與模型組比較△P＜0.05；與唑來磷酸組比較▲P＜0.05；與陽和湯高劑量組比較*P＜0.05。

組 別模型租唑來膦酸組陽和湯高劑量組陽和湯低劑量組藥物劑量（g/kg）—0.30×10-4 23.40 7.80瘤重(g)0.808±0.120 0.399±0.089△0.444±0.053△▲0.546±0.098△▲*抑瘤率（%）—50.61 45.05 32.42

2.4 陽和湯對裸鼠移植人乳腺癌骨轉移血清PTHrP、RANKL、OPG、RANKL/OPG 的影響

根據各組PTHrP、RANKL、OPG 的濃度方差齊性的比較，用LSD 法進行組間比較，陽和湯高劑量組PTHrP 含量明顯低于模型組（P＜0.05），與假手術組、唑來磷酸組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；陽和湯高劑量組對RANKL 的增殖抑制作用，其含量明顯低于模型組，高于假手術組、唑來膦酸組，差異有統計學意義（P＜0.05）；陽和湯高劑量組OPG 含量明顯高于模型組，低于假手術組、唑來膦酸組以及低劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05）。陽和湯高劑量組隊對RANKL/OPG 比值的影響，明顯高于模型組，低于假手術組、唑來磷酸組以及低劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

3 討論

乳腺癌骨轉移屬中醫“骨蝕”、“骨瘤”、“骨痹”、“骨疽”等范疇，骨轉移癌局部腫塊堅硬不移、疼痛、入夜尤甚、皮色不變、面色晦暗等臨床特征，與“陰盛則寒、寒主收引、主凝滯、主痛”等中醫理論相符，屬陰寒證。推測陽虛可能是乳腺癌發生骨轉移的促發因素。則可以通過溫陽散寒的方法防治乳腺癌骨轉移。

陽和湯出自清·王洪緒的《外科證治全生集》[6]，是溫陽散寒代表方。陽和湯方中重用熟地、鹿角膠為君，輔以炮姜炭、肉桂為臣，以麻黃、白芥子為佐，甘草為使藥。全方共奏溫陽補腎、散寒通滯之功。這是溫陽養血散寒通滯的陽和湯治療骨轉移癌的理論依據。前期實驗研究證明溫陽散寒治法有一定抗癌、鎮痛、提高腫瘤浸潤淋巴細胞和樹突狀細胞功能[7]。長期臨床觀察發現，乳腺癌骨轉移患者多有陽氣不足、寒凝瘀滯狀態，化療后患者尤其明顯，驗之以溫陽散寒通滯的陽和湯制劑，確對乳腺骨轉移癌有顯著療效[8]。文獻報道用陽和湯治療骨腫瘤，多數骨轉移癌患者疼痛減輕，服藥期間原有病灶未見擴大及轉移[9]。

乳腺癌骨轉移動物模型是研究人乳腺癌骨轉移的發病機制及其治療措施的重要工具。在實驗動物中，自發性的乳腺癌骨轉移現象很少發生。目前，移植性乳腺癌骨轉移動物模型復制方法有三：①局部注射法；②乳腺癌的原位種植；③血流播散法。采用骨組織局部注射法復制骨轉移模型，這種方法簡便易行，不受多臟器轉移的影響。造模成功率高，模型結果也與臨床上所見的骨轉移狀況相類似[10-11]。

表2 陽和湯對各組裸鼠移植人乳腺癌骨轉移血清PTHrP、RANKL、OPG、RANKL/OPG 的影響 （±s，n=8）

表2 陽和湯對各組裸鼠移植人乳腺癌骨轉移血清PTHrP、RANKL、OPG、RANKL/OPG 的影響 （±s，n=8）

注：與假手術組比較＊P＜0.05；與模型組比較△P＜0.05；與唑來磷酸組比較▲P＜0.05；與陽和湯高劑量組比較＃P＜0.05。

組 別假手術組模型組唑來膦酸組陽和湯高劑量組陽和湯低劑量組藥物劑量（g/kg）— —0.30×10-4 23.40 7.80 PTHrP(ng/mL)44.72±6.26 86.54±15.58＊64.14±8.95＊△52.30±5.77△73.15±6.99＊＃RANKL(pg/mL)188.54±19.78 388.80±86.20＊244.78±23.73＊△331.59±47.81＊▲297.30±30.67＊▲OPG(pg/mL)289.85±39.76 95.65±10.40＊202.31±12.74＊△149.39±22.73＊△▲124.37±7.61＊△▲RANKL/OPG 0.66±0.13 4.07±0.85＊1.21±0.12＊△2.27±0.51＊△▲2.39±0.22＊△▲

正常的骨代謝是通過成骨細胞的成骨作用與破骨細胞的骨吸收作用進行調節，從而保持一種動態平衡[12]。在這個過程中，大量的相關因子參與其中，成為骨微環境主要部分。乳腺癌以溶骨性轉移為主，它以骨組織的破壞吸收為特點，是破骨細胞直接作用的結果[13]。乳腺癌細胞、成骨細胞、破骨細胞和骨基質細胞共同參與這一過程。這些細胞分泌的相關因子在骨轉移發生和發展中起重要作用。其中，腫瘤細胞產生的PTHrP 是主要的破骨細胞激活因子[14]。在腫瘤骨轉移的過程中，起到正性調節作用[15]。PTHrP 刺激成骨細胞或基質細胞合成RANKL，通過未成熟破骨細胞表面的RANK 信號系統，RANKL 刺激轉錄因子起始轉錄，導致未成熟的破骨細胞分化為成熟的破骨細胞[16]；并且同時抑制OPG 的合成。OPG 是RANKL 的無功能受體，它能與破骨細胞表面的RANK 競爭性結合RANKL，在體內、體外情況下均能抑制破骨細胞成熟和活化。目前認為RANKL/OPG 的比例是破骨細胞活性的決定因素之一[17-18]。成骨細胞和破骨細胞之間失去平衡，促進骨吸收作用。其主要作用機制為：骨溶解——釋放生長因子——刺激腫瘤細胞增殖——PTHrP 等破骨細胞激活因子——通過RANKL／RANK 激活破骨細胞——骨溶解，形成惡性循環導致溶骨性轉移的不斷演進[13]。

在骨轉移過程中，OPG 的表達量會很低，PTHrP和RANKL 的表達量增加，這樣就促使骨轉移的發生。而當促進或抑制相關調節因子的產生時，就能夠在一定程度上抑制骨的轉移。通過ELISA 法檢測，發現陽和湯高、低劑量均對相關調節因子產生了調控作用：促進OPG 的表達，抑制PTHrP、RANKL的表達。其中尤以陽和湯高劑量應用效果最為明顯。因此陽和湯抑制乳腺癌骨轉移的作用和機制值得我們更深入研究。

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