黃芪總苷和三七總皂苷配伍對小鼠腦缺血再灌注腦組織能量障礙的影響

黃小平，譚 華，劉文龍，鄧常清

（1.湖南中醫藥大學醫學院，湖南 長沙410007；2.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙410208）

HUANG Xiao-ping1，TAN Hua1，LIU Wen-long2，DENG Chang-qing1

(1.Medical College，TCM University of Hunan，Changsha，Hunan 410007，China;2.Pharmaceutical College，TCM University of Hunan，Changsha，Hunan 410208，China)

黃芪和三七是治療心腦血管疾病的常用中藥。藥物化學研究表明，黃芪總苷（Astragalosides，AST）是黃芪中具有心腦血管藥理作用的主要藥效物質，其主要有效成分是黃芪甲苷。三七總皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）是三七中具有心腦血管效應的主要藥效物質，主要含人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1 和三七皂苷R1。臨床常將黃芪和三七配伍組成復方用于腦梗死的治療，且取得了較好效果[1]，但傳統的生藥配伍存在機制不明確、成分不清楚、質量不可控、效應不穩定等缺點。腦缺血后由于腦組織急性缺血缺氧，導致能量代謝障礙，因此，在腦缺血后盡快恢復腦血流，改善腦組織能量代謝，是防止腦組織進一步損傷的重要措施。已有的研究表明，黃芪總苷能改善缺血心肌組織的能量代謝[2]，三七總皂苷能明顯延緩缺血腦組織ATP 的分解，改善能量負荷[3]。我們前段研究表明，AST 110 mg/kg和PNS 115 mg/kg 分別是抗腦缺血損傷的有效劑量，且兩者配伍對氧化應激損傷有協同或相加的效應[4]。因此，為繼續探討AST 和PNS 配伍抗腦缺血的作用機制，從能量代謝水平研究了該有效劑量配伍對腦缺血再灌注障礙的影響，現將實驗方法及結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級C57BL／6 小鼠120 只，雄性，質量（20±2）g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK（2009-0004）。飼養于室溫20～25 ℃，濕度50%～60%的環境。動物的處理與中華人民共和國科學技術部關于“實驗動物的管理和使用指導意見”相一致。

1.1.2 藥物及含量 AST 是由豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bunge 的根中提取而得，購自成都和康藥業有限責任公司 （批號HK080302），其含量為45%，原始植物保存于成都和康藥業有限公司標本室。AST 用時以0.5%羧甲基纖維素鈉配成相應濃度混懸液。

PNS 是由五加科植物三七Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen.的主根或根莖中提取的皂苷類成分，購自廣西梧州制藥（集團）股份有限公司（批號080628），其含量為93.8%，原始植物保存于廣西梧州制藥（集團） 股份有限公司標本室。PNS 用時以0.5%羧甲基纖維素鈉配成相應濃度混懸液。

依達拉奉 （3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，3-Methyl-1-phenyl-2- pyrazolin-5-one），南京先聲東元制藥有限公司生產，批號80-090104，以生理鹽水配成400 μg/mL 溶液。

1.1.3 試劑 超微量Na+-K+ATP 酶測試盒，總蛋白定量測試盒，均購自南京建成生物工程公司。三磷酸腺苷 （ATP）、二磷酸腺苷 （ADP）、一磷酸腺苷（AMP）標準對照品（進口分裝）由天津一方有限公司提供。其他試劑均為分析純。

1.1.4 儀器 C18-WP 液相柱（產地：上海，型號：Athena）；紫外分光光度計（產地：瑞士，型號：VATROPEC4300PRO）；高效液相色譜儀（產地：美國，型號：Agilent）。

1.2 方法

1.2.1 藥物配伍劑量的確定 根據我們的試驗，AST 在30～240 mg/kg 和PNS 在80～320 mg/kg 劑量范圍下灌胃給藥具有抗小鼠腦缺血的作用，且AST 110 mg/kg 和PNS 115 mg/kg 配伍可以協同抗腦缺血再灌注后腦組織氧化應激損傷[4]，故擬定AST 和PNS 的配伍劑量為AST 110 mg/kg+PNS 115 mg/kg。

1.2.2 動物分組及給藥方法 將小鼠隨機分為假手術組，模型對照組，AST 組(110 mg/(kg·d)，ig)，PNS組 （115 mg/(kg·d)，ig）、AST+PNS 配 伍 組（AST 110 mg/(kg·d)+PNS 115 mg/(kg·d)，ig） 及依達拉奉組 （8 mg/(kg·d)，ip），每組10 只。依達拉奉組以4 mg/kg 腹腔注射給藥（給藥體積10 mL/kg），每日2 次；假手術組、模型對照組予0.5%羧甲基纖維素鈉10 mL/kg 灌胃，其余各組以相同體積灌胃給藥，每日1 次，上午8 點給藥，連續4 d。各組在第4 天給藥1 h 后造模，術前12 h 禁食。

1.2.3 腦缺血模型的建立 按文獻方法[5]制備腦缺血再灌注模型，用動脈夾阻斷雙側頸總動脈20 min，再灌注1 h，假手術組也進行同樣手術，但不阻斷頸總動脈進行腦缺血。于再灌注1 h 后，將小鼠迅速斷頭，去除小腦及腦干后，腦組織待測。

1.2.4 腦組織腺苷酸含量測定 首先，切得視交叉前冠狀腦組織約60 mg，加冷5%高氯酸（腦組織：5%高氯酸=1∶9） 制成10%組織勻漿，4 ℃離心15 min （15 000 r/min），取 上 清 液0.4 mL 加 入3 mol/L 的K2CO30.06 mL，以10% NaHCO3調節pH 至中性，4 ℃離心5 min（3 000 r/min），取上清液進行測定。色譜條件：C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫25 ℃，檢測波長254 nm，流速0.7 mL/min，進樣量10 μL。流動相：pH 6.0 的100 mmol/L 磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液。精密稱 取 標 準 品ATP 16.4 mg，ADP 15.0 mg，AMP 13.1 mg，置同一50 mL 的容量瓶中，用流動相溶解、定容，得濃度分別為ATP 328.0 μg/mL、ADP 300.0 μg/mL 和AMP 262.0 μg/mL 的對照品混合溶液。分別吸取1、2、3、4、5 μL 對照品混合溶液，求得標準曲線的回歸方程。再取上述處理的樣品進樣10 μL 并進行色譜分析，根據峰面積計算ATP、ADP、AMP 含量。按公式計算[6]TAN、EC：

TAN=[ATP]+[ADP]+[AMP]，EC=（[ATP]+0.5×[ADP]）/（[ATP]+[ADP]+[AMP]）。

1.2.5 腦組織Na+-K+-ATP 酶活性測定 取視交叉后腦組織，加冷生理鹽水（腦組織∶生理鹽水=1∶9）制備成10%的組織勻漿，4 ℃離心5 min （1 000 r/min），取上清液按定磷法測定Na+-K+-ATP 酶活性，蛋白濃度測定采用考馬斯亮蘭法。

1.3 統計學分析

2 結果

與假手術組比較，模型組ATP、ADP 含量和TAN 值顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，ATP 含量在各治療組顯著升高（均P＜0.01），且配伍組比AST 組和PNS 單用組升高更顯著 （均P＜0.01）；與模型組比較，ADP 含量在AST 組、配伍組及依達拉奉組均升高顯者(P＜0.01，P＜0.05)，且配伍組ADP 的升高比AST、PNS 單用組更多 （P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，TAN 值在AST+PNS 配伍組和依達拉奉組顯著升高 （均P＜0.05）；在AST-PNS配伍組和依達拉奉組ATP、ADP 含量和TAN 值差異不顯著（均P＞0.05）。析因設計方差分析顯示AST和PNS 配伍對ATP、ADP 和TAN 有交互作用 （均P＜0.01）且配伍組的效應大于單用AST 和單用PNS效應之和，表明AST 110 mg/kg 與PNS 115 mg/kg配伍在抑制ATP、ADP 和TAN 含量降低方面有協同的交互作用。AMP 含量各組間差異均無顯著性意義（P＞0.05）。

與假手術組比較，模型組EC 值顯著降低 （P＜0.01）。與模型組比較，各藥物組腦組織EC 值顯著升高（P＜0.05，P＜0.01)，與AST 組和PNS 單用組比較，AST+PNS 配伍組腦組織EC 值升高顯著（P＜0.05，P＜0.01），EC 值在配伍組和依達拉奉組間沒有統計學意義（P＞0.05）。析因設計方差分析顯示AST 和PNS配伍對EC 有交互作用（P＜0.05）且AST+PNS 配伍組的效應約等于單用AST 和單用PNS 效應之和，表明AST 110 mg/kg 與PNS 115 mg/kg 配伍在抑制EC 降低方面有相加的交互作用。

與假手術組比較，模型組腦組織Na+-K+-ATP 酶活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，AST+PNS 配伍組、AST 組和依達拉奉組腦組織Na+-K+-ATPase活性顯著增強（P＜0.05，P＜0.01），且AST+PNS 配伍組效應比PNS 組更好（P＜0.05）。AST+PNS 配伍組和依達拉奉組間相比較差異沒有明顯不同（P＞0.05）。析因設計方差分析顯示AST 和PNS 配伍對Na+-K+-ATPase 有交互作用（P＜0.05），且配伍組的效應大于單用AST 和單用PNS 效應之和，表明AST 110 mg/kg 與PNS 115 mg/kg 配伍在抑制Na+-K+-ATPase活性降低方面有協同的交互作用。結果見表1。

表1 各組間小鼠腦組織中ATP、ADP、AMP 含量、TAN、EC 值和Na＋-K＋-ATP 酶活性的比較 （±s，n=10）

表1 各組間小鼠腦組織中ATP、ADP、AMP 含量、TAN、EC 值和Na＋-K＋-ATP 酶活性的比較 （±s，n=10）

注：與假手術組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較★P＜0.05，★★P＜0.01；與AST+PNS 配伍組比較☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。

組 別假手術模 型AST PNS AST+PNS依達拉奉ATP(10-3μg/g 組織）291.3±35.0 125.4±14.2△△171.9±19.6★★☆☆167.5±47.9★★☆☆227.3±15.2★★233.5±39.2★★ADP(10-3μg/g 組織）262.2±52.2 194.3±57.7△248.1±57.0★☆219.6±45.4☆☆285.7±64.7★★263.6±62.7★★AMP(10-3μg/g 組織）596.0±89.3 600.5±52.2 530.2±91.5 585.6±114.8 549.7±77.5 583.3±143.8 TAN(10-3μg/g 組織）1 149.2±99.6 920.1±109.7△△960.2±126.9 972.7±169.7 1 061.7±104.3★1 080.4±183.8★EC 0.37±0.04 0.25±0.02△△0.32±0.02★★☆0.29±0.02★☆☆0.35±0.02★★0.34±0.06★★ATP 酶（μmol.Pi/mg.Pr）4.45±1.49 2.34±0.6△△3.29±0.9★3.03±0.61☆4.08±0.96★★3.38±0.92★

3 討論

腦是體內能量代謝最活躍的器官，血流量與耗氧量都大，對缺血、缺氧損傷極為敏感。一旦腦血流供應中斷，能量耗竭，會立即引起腦功能喪失和腦組織的廣泛損傷。

ATP 作為腦組織的主要能量來源，對于維持細胞的生理功能發揮著重要作用。腺苷酸池（TAN）水平和能荷值（EC）是衡量機體、組織和細胞代謝狀態的重要參數，TAN 的大小反映了線粒體的氧化呼吸活性和生成高能磷酸化合物的能力，EC 是動態反映細胞能量平衡的一個參數[7]，可有效評估組織細胞的能量儲備狀態。能荷值高，說明細胞內ATP 生成活躍，反之則表明ATP 生成不足或利用增加。腦缺血再灌注使腦組織內葡萄糖和氧供應不足，有氧氧化發生障礙，ATP 含量下降，ATP 分解產物ADP、AMP 含量增加，隨后ADP、AMP 相繼分解，最終導致TAN 水平的變化和EC 值顯著下降，從而引起細胞內鈣超載、興奮性氨基酸釋放增加、自由基增多以及有氧氧化障礙等[8]。

Na+-K+-ATP 酶催化水解ATP 釋放磷酸鹽，直接供給自由能。其活性能反映機體能量代謝水平和生理功能狀態。腦缺血時，ATP 含量下降，大量自由基產生及興奮性氨基酸的釋放，導致該酶的結構破壞[9]，使其功能下降，ATP 生成更趨減少，使原已存在的能量匱乏更加嚴重，導致ATP 酶活性進一步降低，加重腦損傷[10]。

以往研究證明AST 及其有效成分黃芪甲苷可對抗腦缺血后的氧化應激損傷[11]，抑制腦缺血后血腦屏障通透性升高和心肌細胞能量代謝障礙[12，2]。PNS 及其有效成分人參Rg1 有抗腦缺血再灌注后氧化損傷[13]和抑制鈣離子超負荷，改善能量負荷的作用[14]。有關AST 和PNS 配伍對腦缺血后腦組織能量代謝的影響還未見研究報道。本研究結果表明，腦缺血再灌注1 h 后，腦組織ATP 和ADP 含量、EC和TAN 值顯著下降，Na+-K+-ATP 酶活性降低，說明缺血再灌注后腦組織的能量代謝發生嚴重障礙，AST 可提高ATP、ADP 含量，EC 值以及Na+-K+-ATP酶 活 性，PNS 可 提 高ATP 含 量，EC 值 和Na+-K+-ATP 酶活性，AST+PNS 配伍組可提高ATP、ADP 含量，TAN、EC 值以及Na+-K+-ATP 酶活性。且AST+PNS 配伍組對ATP、ADP 含量、EC 值和Na+-K+-ATP酶活性的效應比AST 或PNS 單用組效應更好，AST和PNS 配伍在抑制腦缺血再灌注后ATP、ADP 含量，TAN 值的下降方面有協同的交互作用，在抑制EC 值和Na+-K+-ATP 酶活性的降低方面有相加的交互作用。表明AST 和PNS 配伍使用可以協同改善腦缺血后腦組織能量代謝，其機制可能與AST 和PNS 通過抗氧化應激損害和改善腦血流來協同延緩腦缺血后ATP 利用和生成、改善能量負荷、增強Na+-K+-ATP 酶的活性有關。

[1]劉紅健，吳國珍，練 文.血栓通加黃芪注射液聯合治療腦梗塞的臨床觀察[J].中成藥，2005，27(9):16-18.

[2]Meng D，Chen XJ，Bian YY，et al.Effect of astragalosides on intracellular calcium overload in cultured cardiac myocytes of neonatal rats[J].Am J Chin Med，2005，33(1):11-20.

[3]王碧江，陳劍鴻，劉松青.三七皂苷對氧化損傷大鼠腦能量代謝及線粒體呼吸功能的影響[J].第三軍醫大學學報，2004，26(5):399-401.

[4]譚 華，黃小平，鄧常清.黃芪總苷和三七總皂苷配伍對小鼠腦缺血再灌注氧化應激的影響[J].中西醫結合學報，2010，8(5):448-452.

[5]Yonekura I，Kawahara N，Nakatomi H，et al.A model of global cerebral ischemia in C57 BL/6 mice[J].J Cereb Blood Flow Metab，2004（24）:151-158.

[6]詹 春，楊 靜，詹 莉.RP-HPLC 法測定異甘草素對腦缺血再灌注小鼠腦能量代謝的影響[J].藥物分析雜志，2005，25(6):639-642.

[7]Manfredi G，Yang L，Gajewski CD，et al.Measurements of ATP in mammalian cells[J].Methods，2002，26(4):317-326.

[8]McPhee S J，Vishwanath R L，Ganong W F，et al.Pathophysiology of disease [M].People’s Medical Publishing House，Beijing，2001：124-165.

[9]Kilic E，Kilic U，Matter CM，et al.Aggravation of focal cerebral ischemia by tissue plasminogen activator is reversed by 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor but does not depend on endothelial NO synthase [J].Stroke，2005，36(2): 332-336.

[10]Zhan C，Yang J.Protective effects of isoliquiritigenin in transient middle cerebral artery occlusion-induced focal cerebral ischemia in rats[J].Pharmacological Res，2006，53(3): 303-309.

[11]Yin Y Y，Li W P，Gong H L，et al.Protective effect of astragaloside on focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats[J].Am J Chin Med，2010，38(3):517-527.

[12]Qu Y Z，Li M，Zhao Y L，et al.Astragaloside IV attenuates cerebral ischemia-reperfusion induced increase in permeability of the blood-brain barrier in rats [J].Eur J Pharmacol，2009（606）：137-141.

[13]Liu Q，Kou J P，Yu B Y.Ginsenoside Rg1 protects against hydrogen peroxide-induced cell death in PC12 cell via inhibiting NF-kB activation[J].Neurochem Int，2011（58）：119-125.

[14]Zhang Y F，Fan X J，Li X，et al.Ginsenoside Rg1 protects neurons from hypoxicischemic injury possibly by inhibiting Ca2+ influx through NMDA receptors and L-type voltage-depedent Ca2+channels[J].Eur J pharmacol，2008（586）:90-99.