應(yīng)用高速逆流色譜分離桑枝酚類成分

羅 雋，孫培文，劉 韶*，李新中*

1中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥劑科，長(zhǎng)沙410008;2中南大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)沙410010

應(yīng)用高速逆流色譜分離桑枝酚類成分

羅 雋1，2，孫培文1，2，劉 韶1，2*，李新中1，2*

1中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥劑科，長(zhǎng)沙410008;2中南大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)沙410010

建立了高速逆流色譜(HSCCC)分離制備高純度的桑枝酚類成分的新方法。分離條件如下：溶劑系統(tǒng)為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶2，v/v)，上相為固定相，下相為流動(dòng)相;流速2.0 mL/min;轉(zhuǎn)速900 rpm;進(jìn)樣量75 mg。收集得到三個(gè)高純度化合物，經(jīng)HPLC、MS、1H和13C NMR等分別鑒定為反式氧化白藜蘆醇(25.2 mg)，反式白藜蘆醇(7.4 mg)和桑辛素M(29.1 mg)。高速逆流色譜可以高效分離桑枝成分，方法簡(jiǎn)便，技術(shù)可行，優(yōu)于傳統(tǒng)的柱色譜法。

HSCCC;桑枝;酚類;氧化白藜蘆醇;白藜蘆醇;桑辛素M

桑枝Ramulus mori.為桑科植物桑Morus alba L.的干燥嫩枝，臨床上可用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、高血壓、高血脂等多種疾病的治療，另有抗黑色素生成、抗氧化作用，其中主要的活性成分就是酚類化合物［1，2］。現(xiàn)有關(guān)于桑枝化學(xué)成分的研究較多，但一般采用柱色譜進(jìn)行分離純化［3-5］，分離周期長(zhǎng)，操作過(guò)程復(fù)雜，而且重現(xiàn)性不好。

高速逆流色譜(High-speed Counter-current Chromatography，HSCCC)是一種不使用固相支撐體或載體的液液分配色譜技術(shù)，不僅分離時(shí)間短，費(fèi)用低，還避免了固相載體帶來(lái)的樣品預(yù)處理要求高和不可逆吸附帶來(lái)的樣品損失、失活變性等，因而在植物有效成分的分離與提純方面得到了廣泛的應(yīng)用［6］。為獲得桑枝中高純度的單體化合物，我們應(yīng)用HSCCC分離技術(shù)對(duì)桑枝提取物進(jìn)行了分離純化，得到了至少三種酚類化合物。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TBE-300A高速逆流色譜儀(上海同田生化技術(shù)有限公司);?KTA prime泵及紫外檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)GE公司);HX21050恒溫器(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);Agilent-1100型高效液相色譜儀;INOVA-400核磁共振儀(美國(guó)Varian公司);HCT型離子阱質(zhì)譜儀(德國(guó)Bruker公司)。

1.2 材料

聚酰胺(80～100目，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠);聚酰胺薄膜(5×10 cm，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠);超純水;甲醇(色譜純，TEDIA COMPANY，INC.);其余試劑為分析純。桑枝飲片(產(chǎn)地湖南，批號(hào)2009081404，湖南振興中藥飲片廠加工，由湘雅醫(yī)院藥劑科劉韶副教授鑒定為桑的干燥嫩枝(Ramulus mori.)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 粗提物的制備

1 kg桑枝用70%的乙醇回流提取兩次，第一次8000 mL，提取時(shí)間為2 h，第二次6000 mL，提取時(shí)間為1 h，合并提取液，減壓濃縮至500 mL。將部分濃縮液(約120 mL，預(yù)先拌樣)加到裝有150 g預(yù)處理過(guò)的聚酰胺的層析柱(95 cm×4 cm，i.d.)上，分別用水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇洗脫，將95%乙醇洗脫液減壓濃縮至干，得到固體430 mg (待分離樣品)，置干燥器內(nèi)保存，備用。

2.2 HSCCC方法

2.2.1 兩相溶劑系統(tǒng)及樣品溶液的制備

HSCCC溶劑系統(tǒng)為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶2，v/v)，將其按比例配制混合于分液漏斗中并劇烈震蕩，分相平衡后分離出上下相并分別超聲脫氣，備用。另稱取75 mg粗提物，加入上下相各5 mL，振蕩使之完全溶解，備HSCCC分離。

2.2.2 分配系數(shù)K值的測(cè)定

從溶劑系統(tǒng)中各取等量上下相溶劑置于試管中，加入適量桑枝提取物，震蕩混勻，靜置分層后分別采用2.3中HPLC條件檢測(cè)，觀察各成分在兩相溶劑中的分配情況。分配系數(shù)K=CS/CM，其中CS指溶質(zhì)在固定相中濃度，CM指溶質(zhì)在流動(dòng)相中濃度，兩者之比等于HPLC中峰面積之比，即K=AS/ AM。適宜的兩相溶劑體系應(yīng)是組分的分配系數(shù)K在0.5～2之間，該方法可用來(lái)進(jìn)行溶劑系統(tǒng)的篩選。

2.2.3 HSCCC分離

開啟泵，以最大流速將固定相泵入HSCCC色譜分離柱中至滿，開啟柱溫箱升溫至25℃，同時(shí)打開主機(jī)，選擇主機(jī)旋轉(zhuǎn)方向?yàn)檎D(zhuǎn)，緩慢調(diào)節(jié)速度由低至高直達(dá)900 rpm，保持平穩(wěn)旋轉(zhuǎn)，以2.0 mL/min流速泵入流動(dòng)相，待流動(dòng)相從出柱口流出，兩相系統(tǒng)在柱中已經(jīng)建立動(dòng)態(tài)平衡后開始進(jìn)樣。將樣品溶液通過(guò)進(jìn)樣環(huán)注入主機(jī)管路，280 nm下檢測(cè)，接收流分。

2.3 HPLC分析

應(yīng)用該HPLC色譜條件篩選溶劑系統(tǒng)并比較HSCCC中流分的純度和出峰時(shí)間。色譜柱為Ultimate XB-C18column(5 μm，250 mm×4.6 mm i.d.)，(Welch，America)，柱溫30℃，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm，流動(dòng)相為甲醇-水梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?～10 min，30%～40%MeOH;10～20 min，40%～60%MeOH;20～25 min，60%MeOH，進(jìn)樣體積為10 μL，流速1.0 mL/min。用面積歸一化法判定含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 HSCCC分離條件的優(yōu)化

3.1.1 溶劑系統(tǒng)的優(yōu)化

備選溶劑系統(tǒng)有正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水①(1∶1.5∶1∶2，v/v)、②(1∶0.5∶1∶2，v/v)、③(1∶1∶1∶2，v/v)、④(1∶0.9∶1∶2，v/v)。通過(guò)分配系數(shù)K值的測(cè)定，溶劑系統(tǒng)①的K值過(guò)大，不僅耗時(shí)長(zhǎng)且分離度也沒(méi)有得到很好的改善;溶劑系統(tǒng)②K值過(guò)小，出峰時(shí)間太快，各峰分離度較差;溶劑系統(tǒng)③和④的K值在最佳范圍內(nèi)，但溶劑系統(tǒng)③的分離度和峰形較好，分離效果最優(yōu)，因此選擇③正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶1∶1∶2，v/v)作為本實(shí)驗(yàn)分離純化的溶劑系統(tǒng)。

3.1.2 其它參數(shù)的優(yōu)化

分別對(duì)轉(zhuǎn)速(850 rpm，900 rpm)和進(jìn)樣量(50 mg，75 mg，100 mg)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)速較高時(shí)能提高固定相保留率，保證好的分離效果;進(jìn)樣量增加可以提高實(shí)驗(yàn)效率，但進(jìn)樣量為100 mg時(shí)，固定相保留率降低且分離效果也下降很多。因此選用轉(zhuǎn)速為900 rpm和進(jìn)樣量為75 mg的條件。

3.2 HSCCC分離制備結(jié)果

圖1 高速逆流色譜圖(正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=1∶1∶1∶2)Fig.1 HSCCC chromatogram(n-hexane∶ethyl acetate∶methyl∶water=1∶1∶1∶2)

采用溶劑系統(tǒng)為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶2，v/v)，上相為固定相，下相為流動(dòng)相;流速2.0 mL/min;轉(zhuǎn)速900 rpm;進(jìn)樣量75 mg的條件進(jìn)行分離，結(jié)果固定相保留率為71%，分離時(shí)間為180 min，根據(jù)HSCCC圖譜(圖1)手動(dòng)分段收集得到五個(gè)組分(Ⅰ-Ⅴ)，分別減壓濃縮干燥，稱重分別為25.2、2.1、7.4、29.1和3.6 mg。

3.3 HPLC分析

采用2.3中HPLC條件對(duì)桑枝待分離樣品及組分Ⅰ-Ⅴ分別進(jìn)行檢測(cè)(圖2)。由圖可知，組分Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ有顯著的單一峰現(xiàn)象出現(xiàn)，用面積歸一化法得到組分Ⅰ和Ⅳ的峰純度為97%，組分Ⅲ的峰純度為90%(重結(jié)晶后純度為95%)，組分Ⅴ的峰純度為87%，組分Ⅱ中峰比較多，后分段接收該部分也沒(méi)有得到純峰，故暫時(shí)不考慮該組分。

圖2 待分離樣品及其HSCCC分離后五個(gè)組分的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of the sample under HSCCC separation and its five fractions

3.4 結(jié)構(gòu)鑒定

將HSCCC分離得到的組分Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ進(jìn)行理化性質(zhì)和MS、1H和13C NMR等的檢測(cè)，各組數(shù)據(jù)和結(jié)果如下：

組分Ⅰ：淡黃色無(wú)定形粉末(MeOH)，在聚酰胺薄膜上顯藍(lán)色熒光，與FeCl3試劑反應(yīng)呈紫色，推測(cè)可能為酚類化合物。APCI-MS m/z：243［MH］-;1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：9.58(1H，s，OH-2)，9.40(1H，s，OH-4)，9.15(2H，s，OH-3'，5')，7.34(1H，d，J=8.4 Hz，H-6)，7.14(1H，d，J=16.8 Hz，H-α)，6.76(1H，d，J=16.4 Hz，H-β)，6.33(3H，br s，H-2'，4'，6')，6.23(1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-5)，6.07(1H，t，J=1.8 Hz，H-3);13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ：158.5(s，C-3'，5')，158.1(s，C-4)，156.0(s，C-2)，140.0(s，C-1')，127.1(d，C-6)，124.6(d，C-β)，123.2(d，C-α)，115.2(s，C-1)，107.2(d，C-5)，104.0(d，C-2'，6')，102.5(d，C-4')，101.3(d，C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7，8］報(bào)道的氧化白藜蘆醇的光譜數(shù)據(jù)基本一致，故確認(rèn)化合物分子式為C14H12O4，且 H-α和 H-β的耦合常數(shù) J=16.4 Hz，表明兩個(gè)氫為反式構(gòu)型，所以確定該化合物為反式氧化白藜蘆醇(trans-oxyresveratrol)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖3。

組分Ⅲ：淡黃色無(wú)定形粉末(MeOH)，在聚酰胺薄膜上顯淺藍(lán)色熒光，與FeCl3試劑反應(yīng)呈紫色，推測(cè)可能為酚類化合物。APCI-MS m/z：227［MH］-;1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：9.56(1H，s，OH-4)，9.20(2H，br s，OH-3'，5')，7.35(2H，d，J= 8.6 Hz，H-2，6)，6.97(1H，d，J=16.2 Hz，H-α)，6.78(1H，d，J=16.2 Hz，H-β)，6.72(2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5)，6.35(2H，d，J=2.0 Hz，H-2'，6')，6.13 (1H，d，J=2.0 Hz，H-4');13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ：158.2(s，C-3'，5')，157.4(s，C-4)，139.1 (s，C-1')，128.2(d，C-β)，127.9(d，C-2，6)，127.4 (s，C-1)，125.6(d，C-α)，117.1(d，C-3，5)，104.9 (d，C-2'，6')，102.5(d，C-4')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報(bào)道的白藜蘆醇的光譜數(shù)據(jù)基本一致，故確認(rèn)化合物分子式為C14H12O3，且H-α和H-β的耦合常數(shù)J =16.4 Hz，表明兩個(gè)氫為反式構(gòu)型，所以確定該化合物為反式白藜蘆醇(trans-resveratrol)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖3。

組分Ⅳ：黃色無(wú)定形粉末(MeOH)，在聚酰胺薄膜上顯藍(lán)色熒光，與FeCl3試劑反應(yīng)呈紫色，推測(cè)可能為酚類化合物。APCI-MS m/z：241［MH］-;1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：9.59(1H，s，OH-6)，9.46(2H，br s，OH-3'，5')，7.38(1H，d，J= 8.0 Hz，H-4)，7.08(1H，br s，H-7)，6.92(1H，s，H-3)，6.74(1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-5)，6.68(2H，d，J=2.0 Hz，H-2'，6')，6.21(1H，t，J=2.0，H-4');13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ：158.8(s，C-3'，5')，155.7(s，C-7a)，155.2(s，C-6)，153.9(s，C-2)，131.6(s，C-1')，121.1(d，C-4)，120.7(d，C-3a)，112.4(d，C-5)，102.6(d，C-3)，102.2(d，C-2'，6')，101.5(d，C-4')，97.4(d，C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報(bào)道的桑辛素M的光譜數(shù)據(jù)一致，故確認(rèn)分子式為C14H10O4，該化合物為桑辛素M(moracin M)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖3。

圖3 三種酚類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.3 Chemical structures of three phenol compounds

組分Ⅴ：淺黃色無(wú)定形粉末(MeOH)，在聚酰胺薄膜上顯淡藍(lán)色熒光，與FeCl3試劑反應(yīng)呈紫色，表明可能為酚類化合物。另經(jīng)反式白藜蘆醇365 nm照射實(shí)驗(yàn)推測(cè)該化合物可能為順式白藜蘆醇(cisresveratrol)，圖4為反式白藜蘆醇在365 nm下照射10 min后的HPLC圖譜，其新生成物質(zhì)的保留時(shí)間與組分Ⅴ的基本一致，且紫外掃描圖也與組分Ⅴ及文獻(xiàn)報(bào)道的順式白藜蘆醇的光譜圖一致［9］。因該組分量太少且純度較低，不利于純化，故沒(méi)有進(jìn)行MS、1H和13C NMR的檢測(cè)。

圖4 反式白藜蘆醇在365 nm照射后的HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatography of trans-resveratrol after exposure to 365 nm ray

4 小結(jié)

以往對(duì)桑枝成分的分離多采用傳統(tǒng)的柱色譜法，硅膠，Sephadex LH-20及RP-18等多種填料的色譜柱反復(fù)交互使用，不僅操作繁瑣，而且文獻(xiàn)中往往沒(méi)有體現(xiàn)柱色譜分離的具體參數(shù)，他人無(wú)法重現(xiàn)其實(shí)驗(yàn)。而HSCCC操作簡(jiǎn)單，周期短，不需要任何固態(tài)載體，避免了不可逆吸附，且分離條件及相關(guān)參數(shù)明確，保證了良好的重現(xiàn)性，且用該法分離得到的高純度酚類化合物可作為對(duì)照品用于桑枝的質(zhì)量控制研究。

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Separation of Phenols from Ramulus mori.by High-Speed Counter-Current Chromatography

LUO Jun1，2，SUN Pei-wen1，2，LIU Shao1，2*，LI Xin-zhong1，2*1Department of Pharmacy，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410008，China;2School of Pharmacy，Central South University，Changsha 410010，China

A new method was developed for the separation and purification of phenols by high-speed counter-current chromatography(HSCCC)from extract of Ramulus mori.The separation condition was determined as follows：n-hexane：ethyl acetate：methyl：water(1∶1∶1∶2，v/v)as the solvent system，the upper phase as the stationary phase，the lower phase as the mobile phase，2.0 mL/min of flow-rate，900 rpm of rotation speed，and 75 mg of injection amout.Transoxyresveratrol(25.2 mg)，trans-resveratrol(7.4 mg)，and moracin M(29.1 mg)were obtained and identified by HPLC，MS，1H and13C NMR.It indicated that HSCCC can be used for separating the active compounds of Ramulus mori efficiently and exhibited many advantages compared with the column chromatography method.

HSCCC;Ramulus mori.;phenols;oxyresveratro1;resveratrol;moracin M

1001-6880(2012)04-0486-04

2010-10-11 接受日期：2011-03-07

*通訊作者 Tel：86-731-84327454;E-mail：Xylixin@medmail.com.cn; liushao999@hotmail.com

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