豬骨膠原蛋白肽緩解高脂飲食誘導小鼠肝臟氧化應激的基因芯片分析

林云鑒，樂國偉*，施用暉，孫 進，李亞欣

1江南大學食品學院食品營養與功能因子研究中心;2食品科學與技術國家重點實驗室，無錫214122

豬骨膠原蛋白肽緩解高脂飲食誘導小鼠肝臟氧化應激的基因芯片分析

林云鑒1，2，樂國偉1，2*，施用暉1，2，孫 進1，2，李亞欣1

1江南大學食品學院食品營養與功能因子研究中心;2食品科學與技術國家重點實驗室，無錫214122

本研究探討豬骨膠原蛋白肽降血脂作用和抑制高脂飲食誘導肝臟抗氧化應激的作用機理。40只小鼠分為5組，分別飼喂6 w正常日糧、高脂日糧、添加1.6%鈣的高脂日糧、添加1%膠原蛋白肽的高脂日糧和添加1.6%鈣+1%膠原蛋白肽的高脂日糧。研究發現：與正常組相比，高脂日糧小鼠血脂和體重明顯升高。1.6%鈣處理可抑制體重過度升高，1%膠原蛋白肽和高鈣可協同抑制調節血脂，防止體重升高。高脂主要通過影響肝臟生理節律和過氧化物酶體增生物激活受體信號通路引起脂代謝異常，高鈣和骨膠原蛋白肽可顯著抑制肝臟氧化應激，抑制生理節律紊亂。

膠原蛋白肽;高脂日糧;基因芯片;氧化應激

長期高脂膳食會使肝臟攝取脂肪和貯存增多，引起細胞脂肪變性和血清游離脂肪酸(FFA)升高，肝臟β氧化作用加強，導致產生過多氧自由基(ROS)，ROS攻擊生物大分子，最終導致諸如動脈粥樣硬化、糖尿病、炎癥、癌癥和衰老等疾病的發生［1］。

蛋白質和肽類抗氧化可清除體內過量的自由基。膠原多肽是各種動物膠原蛋白(皮、骨、關節等)經蛋白酶等降解后得到的相對分子量在20 kDa以下的產物，其消化吸收性不僅大大提高，同時還具有膠原蛋白的功能特性［2］。研究發現，膠原多肽具有減緩動脈硬化、抗氧化、降血壓、改善骨質疏松、促進皮膚膠原代謝等功能［3］。

本研究用微波輔助水解法制備了豬骨膠原蛋白肽［4］，并發現豬骨膠原蛋白肽具有抑制高脂引起小鼠肝臟氧化應激的作用［5］，高鈣日糧可與豬骨膠原蛋白肽協同發揮降血脂作用。本研究旨在探討其發揮抗氧化作用的機理。

1 材料與方法

1.1 材料

表1 日糧配方組成(%)Table 1 Composition of diet(%)

1.2 動物實驗及肝臟樣品采集

選用4周齡清潔級雄性KM種小鼠(上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，生產許可證號碼：SCXK(滬)2007.0005)，體重約18±2 g。正常日糧適應1周后隨機分為5組，每組8只，依次為：①對照組(0.8%Ca，w/w)(Control);②高脂組(16.10%豬油，0.8%Ca，w/w)(High.fat diet，HF);③高脂高鈣組(16.10%豬油，1.6%Ca，w/w，HFHC);④高脂+1%骨膠原肽組(16.10%豬油+1%BCP);⑤高脂高鈣+1%骨膠原肽組(16.10%豬油+1.6%Ca+ 1%BCP);日糧配方見表1。小鼠同室分籠飼養，溫度控制在23±2℃，濕度60%，自然光照，自由采食和飲水。

每周稱重一次，飼喂6 W后每組取8只小鼠禁食12 h，摘眼球取血，2919×g離心10 min后分離血清，斷頸椎處死，迅速稱取肝臟用于基因表達譜分析。

1.3 血脂水平測定

用試劑盒測定血清中TC、HDL-C、LDL-C和總TG含量，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 基因表達譜分析

用RNeasy Mini Kit提取細胞總RNA，取10 μg，反轉錄為cDNA后利用Affymetrix GeneChip 3'擴增試劑進行擴增，用生物芯片高產量RNA轉錄子標記試劑合成生物素標記互補RNA(cRNA)。取10 μg，按照Affymetrix基因芯片表達分析技術手冊(http：//www.affymetrix.com/upport/technical/manual/ expression.man ual.affx)，在雜交爐中雜交到Affymetrix MOE430 2.0基因芯片。用基因芯片掃描儀讀取熒光信號信息。基因芯片分析按照Affymetrix基因芯片表達分析技術手冊進行。用 Microarray Suite 5.0進行信號強度平均化處理。基因改變用fold change(FC)表示。

魚塘的建設和改造，不外乎以下幾個方面：小池改大池或大池改小池，淺塘改深塘，漏水塘改保水塘，死水塘改活水塘，低池埂改高池埂，但同時也要根據當年所需要養殖的品種及養殖模式而確定改造建設的規劃與設計。

1.5 數據分析

利用Onto-Tools(http：//vortex.cs.wayne.edu)在線分析工具中的pathway express分析顯著相關基因通路，顯著改變的基因通路用影響因子(IF)表示，IF值按以下公式計算：

公式中Pi為測定的特定的通路，pi為得到一個統計數值的概率，Nde為偶然發生的幾率，PF為特定通路中所有基因的干擾因素，△E為用數學方法決定的標記基因的標準測量表達改變。

血脂及體重數據為平均值±標準偏差，用SPSS軟件的單因素方差分析分析，用Tukey法進行多種比較。

2 實驗結果

2.1 小鼠體重和血脂

試驗期間小鼠體重均有不同程度的增加。試驗末期高脂組小鼠增重顯著高于其他組(P＜0.05) (表2)。從表3可以看出，高脂日糧處理小鼠血清TC、LDL-C和TG顯著升高(P＜0.05)，而HDL-C顯著降低。高鈣處理僅對高脂引起TC上升有抑制作用(P＜0.05)，但無法恢復正常水平。1%BCP處理和高鈣+1%BCP處理后，小鼠各項血脂與正常對照無顯著差異，具有顯著的降血脂作用。

表2 試驗期間小鼠體重變化(g)Table 2 Weight gain of mice during experiment(g)

表3 高鈣和骨膠原肽對小鼠血脂水平的影響Table 3 Effects of bone collagen peptides on lipid level in serum of mice(mmol/L)

2.2 基因表達改變的總體分析

根據Uunigen ID對MOE430 2.0基因芯片重復probe set進行剔除后，芯片共包含了45038條基因或SETs。從表4可以看出，BCP處理后誘導表達的上調基因高于高脂處理，而高脂處理誘導表達的下調基因高于BCP處理(表4)。

表4 小鼠肝臟表達顯著改變的基因數目Table 4 Number of express changed genes

2.3 肝臟顯著改變基因通路及相關基因

Pathway express分析的結果表明，高脂處理后顯著改變的通路有5個(表5)。其中生理節律通路改變最為顯著，IF高達19。在堿基切除修復通路中，NEIL3顯著上調，基因改變(FC)高達15.17。該基因主要負責切除氧化反應產物氧化嘌呤如FapyG和FapyA。

BCP+高脂處理后，小鼠肝臟有12個基因通路發生顯著改變，表5列出了相關性最強的7個通路。其中細胞粘著分子信號通路改變最為顯著(IF值高達401)，該通路中有兩個基因表達被顯著抑制，包括內皮或上皮細胞緊密連接基因claudin 1(Cldn1，-2.58)和神經髓鞘蛋白零家族基因 1(Mpzl1，-2.52)。與高脂處理完全相反，BCP處理后，堿基切除修復通路中NEIL3的表達被極顯著抑制(-22.44)。BCP處理后，有5個重要的細胞周期調節基因表達發生顯著改變，其中G1期調控基因S期周期蛋白依賴激酶(Cip1，Cdkn1a，P21cip1)顯著下調(-3.83)，G1/S期調控基因細胞周期蛋白E2(Ccne2，CCNE)表達顯著上調(2.57)，G 2/M期過渡抑制因子wee1和Cdc14表達也顯著上調(4.91，2)，同時，DNA損傷應激基因Gadd45γ表達也顯著上調(3.16)。Ccne2、Cdkn1a和Gadd45 g三個基因也出現在P53基因通路，期表達模式可導致G1期阻滯。BCP處理誘導了Acot3、Acox1和Elovl6三個不飽和脂肪酸合成通路基因上調，表達量分別為2.17、2.64和2.37。Wnt信號通路信號上游重要基因Wnt5b表達顯著上調(2.92)，可能激活Wnt通路，阻遏成脂過程。

表5 不同處理后小鼠肝臟顯著受影響的基因通路Table 5 Significantly changed gene pathways in liver

過氧化物酶體增生物激活受體(PPAR)信號通路PPAR signaling pathway 11.001 4.06E-05 2.00E-04黑色素瘤Melanoma 7.499 0.01410325 0.004705堿基切除修復Base excision repair 7.423 0.087464771 0.005032脂肪組織細胞因子信號通路Adipocytokine signaling pathway 5.388 0.165249107 0.029200 HF+BCP處理細胞粘著分子Cell adhesion molecules(CAMs) 401.422 0.285373 1.86E-172生理節律Circadian rhythm 25.578 2.51E-08 2.07E-10堿基切除修復Base excision repair 9.031 0.216017 0.001200細胞周期Cell cycle 8.520 8.73E-04 0.001899不飽和脂肪酸合成Biosynthesis of unsaturated fatty acids 7.742 9.66E-04 0.003796 p53信號通路p53 signaling pathway 5.703 0.009671 0.022361過氧化物酶體增生物激活受體信號通路PPAR signaling pathway 5.166 0.014238 0.035192

2.4 生理節律和PPAR信號通路的改變

如圖1所示，高脂處理主要引起生理節律通路中節律基因Period2(Per2)基因表達下調(-2.14)，該基因在此通路具有最重要的地位。BCP處理后節律基因Period2的表達抑制被逆轉(3.13)，同時節律基因Period3表達被誘導(2.14)，而核受體亞家族基因(Nr1d1或 Rev-erba)、晝夜節律鐘基因BMAL1(Arntl)和生物鐘基因Clock這三個生理節律關鍵功能基因的表達被顯著抑制，表達值分別為-2.3、-2.06和-2.09。

如圖2所示，過氧化物酶體增生物激活受體信號通路中與脂肪代謝有關的細胞色素P450第7家族，alpha亞家族多肽表達顯著下調(-2.51)信號接受部位的脂肪酸結合蛋白(adipocyte，3.32和epidermal(aP2)，2.29)顯著上調，信號下游與脂肪細胞分化有關的脂肪細胞因子(adiponectin)顯著上調(2.69)，該基因也是脂肪組織細胞因子信號通路唯一顯著改變的基因，是脂肪組織細胞因子信號通路的一個重要信號分子。膽固醇7α-羥化(Cyp7a1)表達顯著下調(-2.51)。adipocyte表達上調，介導大量低密度脂蛋白進入肝細胞，通過構成性表達PPARa下調CYP7A1，抑制膽固醇代謝。通過PPARg激活Ap2和ADIPO表達，促進脂肪細胞分化，引起肝脂肪浸潤及脂肪肝。

圖1 不同處理對生理節律通路基因表達的影響Fig.1 Express changed genes in circadian rhythm pathway

圖2 不同處理對PPAR信號通路基因表達的影響Fig.2 Express changed genes in PPAR signaling pathway

3 討論

本研究顯示高鈣和骨膠原蛋白肽具有顯著的協同降血脂作用，這種作用主要通過調節肝臟基因表達實現。本研究中，高脂組小鼠血清低密度脂蛋白顯著升高，可能與高脂飼料對肝臟生理節律信號通路的調控有關。低密度脂蛋白的主要來源之一是肝合成后直接分泌到血液，說明，高脂處理加速肝臟低密度脂蛋白的合成。研究表明，生理節律蛋白BMAL1/CLOCK二聚體可通過多種途徑促進脂肪積累和脂肪細胞分化［6］。高脂飲食上調肝臟BMAL1/CLOCK抑制劑 Per的表達，可能釋放BMAL1/CLOCK，導致肝脂肪累積，并向血液運輸脂蛋白。本研究中，高脂處理后，肝臟過氧化物酶體增生物激活受體信號通路偏向于脂肪代謝抑制和脂肪細胞分化，也可證明以上推論。

有研究表明，生理節律與過氧化物酶體增生物激活受體信號通路有直接的聯系［7］，其主要鏈接點為PPARa。PPARa的激活受BMAL1/CLOCK二聚體的調控。本研究中，高脂日糧誘導了PPARa介導脂肪細胞分化的激活，這一過程可能應該與生理節律通路的改變有關。

此外，有研究顯示，高鈣膳食可抑制脂肪吸收［8］，本研究中高鈣處理抑制高脂引起體增重增加可能與此有關，但是高鈣對血脂沒有顯著的影響，說明高鈣僅僅抑制脂肪吸收，但無法抑制肝臟脂代謝紊亂。BCP和高鈣+BCP處理對體重和血脂都有顯著作用，說明BCP可能直接抑制肝臟氧化應激并調節肝臟脂肪代謝。

高脂處理引起NEIL3表達顯著上調，而BCP處理后，NEIL3表達顯著下調，說明，高脂處理誘導肝臟發生了明顯氧化應激，BCP對此有顯著抑制作用。有研究證明在體內羥脯氨酸游離的4-羥基能清除超氧自由基和羥基自由基，發揮抗氧化作用［9］。

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5 Li YX(李亞欣)，Le GW(樂國偉)，Wang JY(王潔昀)，et al.Effects of collagen peptides on antioxidant capacity and serum lipid metabolism of mice fed with high fat diet.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2011，23：5 4-58，68.

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Inhibition of Liver Oxidative Stress by Pig Bone Collagen Peptide-a Microarray Study

LIN Yun-jian1，2，LE Guo-wei1，2*，SHI Yong-hui1，2，SUN Jin1，2，LI Ya-xin11The Research Center of Food Nutrition and Functional Factors，School of Food Science and Technology，Jiangnan University;2The State Key Laboratory of Food Science and Technology Jiangnan University，Wuxi 214122，China

This study was aimed to explore the effect of pig bone collagen peptide on high fat induced weight gain and blood lipid increase.Forty mice were divided into 5 groups，and administrated with normal diet，high fat diet，high fat diet containing 1.6%Ca，high fat diet containing 1%pig bone collagen peptide，and high fat diet containing high Ca and collagen peptide，respectively.The results showed that high Ca intake could prevent high fat induced weight gain.Pig bone collagen peptide could significantly prevent both increase in weight and blood lipid.Microarray analysis revealed that high fat induced molecular circadian rhythm disorder in liver which might be the reason for disorder of lipid metabolism.Bone collagen peptide prevented circadian rhythm disorder and oxidative stress.

pig bone collagen peptide;high fat diet;DNA microarray;oxidative stress

1001-6880(2012)04-0454-06

2011-06-21 接受日期：2011-09-30

國家863計劃(2007AA10Z325)

*通訊作者 Tel：86-510-85917789;E-mail：lgw@jiangnan.edu.cn

R151.2

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