浙江楊梅品種遺傳差異的SRAP分析

葛 夢，喻衛武，周明兵，王同標，楊 萍*

（1.浙江農林大學林業與生物技術學院，浙江 臨安 311300；2.浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300；3.浙江省臺州市黃巖區院橋楊梅良種場，浙江 臺州 318025）

楊梅（Myrica rubra）特產于中國，主要分布在長江流域以南，海南省以北的山地。浙江、江蘇、福建、湖南、江西、廣東等省都將其作為重要果樹種植，其中以浙江省栽培面積最廣且品質最佳[1]。目前，浙江楊梅栽培種主要以東魁、荸薺種、晚稻楊梅、丁岙梅這四大傳統良種為主，同時近年來又從自然變異中選育出早薺蜜梅、晚薺蜜梅等新品種[2～3]。雖然這些楊梅品種在果實品質、熟期、葉形、植株形態等性狀上有著一定的差異，可以通過農藝性狀的比較進行區分[4]，但僅從農藝性狀上無法了解其分子水平上的遺傳差異程度。

近年來，分子標記技術在研究楊梅親緣關系和遺傳多樣性上應用廣泛[5～11]。相關序列擴增多態性（SRAP）標記是Li等[12]提出的利用特定引物對ORFs區域（Open Reading Frames）進行擴增的新型分子標記，與其它標記比較，其結合了大多數標記的優點：在基因組中分布均勻，簡便、穩定、效率較高，是遺傳多樣性和圖譜構建等研究較理想的標記[13]。目前已被應用于多種植物的遺傳多樣性研究[14～15]，但在楊梅的研究中尚未見報道。

本文采用SRAP標記技術評價9個浙江主栽楊梅品種的遺傳多樣性，以期為楊梅分類和雜交育種的親本選擇提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

以浙江省主要栽培的9個楊梅品種為試驗材料（表1），于2011年5月取自臺州市黃巖區院橋楊梅良種苗圃。采取各品種生長健壯、無病蟲害的嫩葉，于實驗室－70℃冰箱保存備用。

表1 試驗材料Table1 Materials used in the study

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用改進的 CTAB法提取楊梅基因組DNA[16]，DNA用TE溶解，經紫外分光光度計、0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度和純度。將經檢驗合格的DNA樣品定量至100 ng/μL，于－20℃儲存備用。

1.2.2 SRAP分析 引物采用Li等[12]發表的引物（表2），由上海Sangon合成。PCR反應體系如下：在20 μL體積中，含60 ng模板DNA；正、反向引物各10 mmol/L；0.2 mol/L dNTPs；2 mmol/L MgCl2；1U Taq DNA聚合酶；1×PCR反應緩沖液。反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火1min，72℃復性1 min，5個循環；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃復性1 min，35個循環；72℃終延伸10 min；4℃結束保存。PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測。

表2 SRAP分析所用引物及其序列Table2 The sequence and primers of SRAP

1.3 數據處理

讀取電泳條帶，按每個樣品電泳條帶有或無記錄，條帶存在時賦值為1，無條帶賦值為0。根據Nei-Li相似系數法分別計算各個品種間的遺傳相似性系數（GS）和遺傳距離（GD, GD = 1－GS），聚類用不加權組平均法進行。用NTSYS-pc軟件按照Nei-Li進行作圖，對得到的遺傳相似性系數矩陣進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 SRAP多態性分析

通過8個正向引物和10個反向引物組成的80個引物組合對供試楊梅品種的DNA進行預擴增，從中篩選了24對多態性好、擴增穩定的引物組合。利用這24對SRAP引物對9個楊梅品種進行PCR擴增分析。圖1為引物組合ME6＋EM2的PCR擴增產物電泳圖。對電泳結果進行統計分析，結果如表3。從表3中可以看到，24對多態性引物共擴增得到157條條帶，其中多態性條帶121條，平均每對引物產生6.54條條帶和5.04條多態性條帶。不同的引物組合產生的多態性條帶的百分率相差較大，從33.33%到100%不等，平均為75.98%。同時，不同引物組合檢測到的SRAP標記的等位變異數不同，ME8＋EM3在供試材料中僅檢測到2種等位變異，而ME1＋EM1、ME4＋EM5和 ME5＋EM10檢測到最多的等位變異數（8種），平均每個引物組合檢測到5.33種等位變異。此外，由表3可知，不同引物組合的多態信息含量（PIC）各不相同，24個引物組合的PIC值為0.423 5 ～ 0.856 4，平均0.668 9。

圖1 引物組合ME6＋EM2的PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果Figure1 PCR products from primers ME6 +EM2 by agarose gelelectrophoresis

表3 SRAP引物組合及擴增結果Table3 SRAP primer combinations and amplified bands

2.2 遺傳距離和聚類分析

根據遺傳相似表（表4），9個樣品的遺傳系數為0.523 2 ～ 0.860 9，表明各個樣本之間存在著較為廣泛的遺傳多樣性，品種間的變異較為豐富。其中親緣關系最近的是早薺蜜梅和晚薺蜜梅以及黑晶和黃巖水梅，最遠的是晚稻楊梅和黃巖水梅。

根據UPGMA聚類的結果（圖2），在遺傳相似系數為0.77時，可將9個楊梅品種分為3類。其中黃巖水梅、黑晶、早薺蜜梅、晚薺蜜梅、早大梅、東魁聚為一類；其余樣品均單獨聚為一類。浙江省的傳統4大良種——東魁、荸薺種、丁岙梅、晚稻楊梅分別位于不同的大類中。

圖2 9個楊梅品種聚類圖Figure2 Dendrogram of 9 M.rubra cultivars

表4 9個楊梅材料的遺傳相似表Table4 Genetic similarity matrix of 9 Myrica rubra cultivars based on SRAP

3 結論

本文采用SRAP標記技術對9個浙江主栽的楊梅品種進行遺傳差異研究，從80對引物中篩選出24對多態性引物進行PCR擴增。共擴增出157個位點，其中多態性位點121個，從分子水平基本反映了這些品種的親緣關系的遠近程度，證實了浙江楊梅主栽品種具有比較豐富的遺傳多樣性，該結果可以為楊梅分類、雜交育種研究的親本選擇等提供參考依據。

4 討 論

4.1 供試樣品間的遺傳關系與新品種選育

本研究利用24對SRAP引物對浙江省主要的9個楊梅品種進行遺傳差異研究，其遺傳系數為0.523 2 ～ 0.860 9，各對引物的多態信息含量（PIC）平均達到0.738 4，表明9個楊梅品種間存在比較豐富的遺傳差異，這與前人用RAPD、ISSR等標記得到的結果類似[6,10]。

SRAP聚類分析表明供試楊梅材料的遺傳相似程度與原產地地理分布相關。供試樣品中東魁、荸薺種、晚稻楊梅和丁岙梅是浙江省主要栽培的四大傳統良種[4]，栽培歷史悠久，并各自分屬于臺州黃巖、寧波慈溪、舟山定海和溫州甌海的地方品種，原產地的地理分布相對獨立。在用UPGMA方法聚類時，于遺傳相似系數0.80處，均被歸為不同的類，這與林伯年等[7]利用ISSR標記和張水明[11]利用SSR標記分析得到的結果相符。黃巖水梅、黑晶、早大梅、東魁均是臺州地區的品種[4]，在聚類圖中集中分布，遺傳距離比較近。早薺蜜梅和晚薺蜜梅都是由荸薺種中選育的良種，在聚類圖上兩者的遺傳距離非常近，但與荸薺種的遺傳距離較遠，甚至位于不同的大組中；張水明利用SSR標記得到的結果也顯示早薺蜜梅、晚薺蜜梅和荸薺種楊梅的親緣關系較遠，并認為可能由于他們變異的來源不同導致：早薺蜜梅為荸薺種的實生早熟變異，晚薺蜜梅為荸薺種的晚熟營養系變異[11]。

根據遺傳相似系數和聚類得到的結果，在進行楊梅雜交育種時可根據育種目標選擇具有不同優良性狀且遺傳差異較大的品種作為父母本。

4.2 SRAP在楊梅中的可行性分析

24對多態性引物共擴增出121條多態性條帶，平均5.08條，且單引物最多能產生8條多態性條帶，這與M Ferriol等[14]在甜瓜、林忠旭等[15]在棉花研究中得到的結果相當。試驗結果顯示SRAP在楊梅中擴增得到的條帶清晰，產率較高，可以在楊梅中產生較好的多態性。

SRAP擴增ORFs區域是基因序列的重要組成部分，也是產生不同品種間差異的重要因素[17]。SRAP技術在育種目標性狀的評價方面明顯優于RAPD標記[18]，有較高的多態性標記比率[15]，是一個評價遺傳多樣性、品種鑒定和系統發生的有效工具[19]。本研究結果顯示SRAP標記的聚類結果與品種來源的地域基本吻合，說明利用SRAP標記評價楊梅品種的遺傳多樣性是可行的，并且可以通過擴大引物對數和供試楊梅品種數，在分子水平上為楊梅各品種的指紋圖譜構建、種質資源的鑒定、篩選和利用等提供理論依據。

[1]繆松林，王定祥.楊梅[M].杭州：浙江科學技術出版社，1987.17－40.

[2]戚行江，梁森苗，鄭錫良, 等.特早熟楊梅新品種‘早薺蜜梅’[J].園藝學報，2003，30（6）：759.

[3]戚行江, 梁森苗, 鄭錫良，等.優質晚熟楊梅新品種‘晚薺蜜梅’[J].園藝學報，2004，31（1）：136.

[4]鄭勇平.楊梅[M].北京：中國林業出版社，2002.21－23.

[5]邱英雄，傅承新，孔航輝.楊梅不同品種的ISSR分析[J].農業生物技術學報，2002，10（4）：343－346.

[6]錢劍林，俞文生，王化坤，等.江浙地區楊梅主要品種的ISSR分析[J].植物資源與環境學報，2006，15（3）：17－20.

[7]林伯年，徐林娟，賈春蕾.RAPD技術在楊梅屬植物分類研究中的應用[J].園藝學報，1999，26（4）：221－226.

[8]潘鴻，何新華，李一偉，等.廣西野生楊梅資源遺傳多樣性的ISSR分析[J].果樹學報，2008，25（3）：353－357.

[9]謝小波，求盈盈，戚行江，等.楊梅雌、雄種質遺傳關系的RAPD和ISSR分析[J].果樹學報，2008，25（2）：198－202.

[10]謝小波，求盈盈，戚行江，等.浙江楊梅品種遺傳差異的RAPD和ISSR分析[J].浙江農業學報，2008，20（1）：1－5.

[11]張水明.基于AFLP和SSR分子標記的中國楊梅遺傳多樣性分析[D].杭州：浙江大學，2009.

[12]Li G, Quiros C F.Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new markers system based on a simple PCR reaction: Its application to mapping and gene tagging in Brassica[J].Theor Appl Genet, 2001, 103（2～3）: 455－461.

[13]譚碧玥，王源秀，徐立安.分子標記SRAP及其在林木研究中的應用[J].世界林業研究，2009，22（5）：44－50.

[14]Ferriol M, Pico B, Nuez F.Genetic diversity of a germplasm collection of cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers[J].Theor Appl Genet,2003, 107（2）: 271－282.

[15]林忠旭，張獻龍，聶以春.新型標記SRAP在棉花F2分離群體及遺傳多樣性評價中的適用性分析[J].遺傳學報，2004，31（6）：622－626.

[16]孫志棟，柴春燕，袁妮娜，等.楊梅基因組 DNA提取方法篩選和優化研究[J].生物技術通報，2007（6）：105－112.

[17]李慧芝，尹燕枰，張春慶，等.SRAP在蔥栽培品種遺傳多樣性研究中的適用性分析[J].園藝學報，2007，34（4）：929－934.

[18]Ferrol M, Pico B, Cordava P F.Molecular diversity of a germplasm collection of sqash (Cucurbita moschata) determined by SRAP and AFLP makers[J].Crop Sci, 2004（44）: 653－664.

[19]Budak H, Shearman R C, Parmaksiz I.Molecular characterization of Buffalograss germplasm using sequence-related amplified polymorphism markers[J].Theor Appl Genet, 2004, 108（2）: 328－33.