正交設計金英黃歸液透皮劑的制備

郭 慶，何炳坤，易 瓊，朱 偉，李圓方，王 魯

（1.貴州大學 貴州省生化工程中心，貴州 貴陽550025；2.安徽科寶生物工程有限公司，安徽 淮北235025；3.北京生泰爾生物科技有限公司，北京 昌平102206；4.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽550025）

近年來，中藥治療奶牛乳房炎越來越引起國內外學者的重視，且有些中藥治療明顯優于青、鏈霉素類藥物［1－2］，其大多通過口服和灌注方式給藥治療乳房炎。而使用透皮給藥系統（Transdermal therapeutic system，TTS）給藥治療奶牛乳房炎也有報道［3－4］，用中藥透皮劑治療奶牛乳房炎既避免了肝臟首過效應，又降低了胃腸道的毒副反應和機體的應激反應，使其在奶牛乳房炎上具有廣闊的應用前景，同時也為寵物臨床用藥提供參考依據。為此，本試驗采用正交試驗設計考查制備金英黃歸液透皮劑的因素，并進行穩定性檢測，通過透過率檢測其透過效果。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 金銀花、蒲公英、連翹、芙蓉花、瓜蔞、大黃、黃芪、當歸等八味中藥均為生藥，購于貴陽市云巖區頭橋中藥店，并經貴州大學中藥實驗室鑒定；綠原酸標準品，購于中國藥品生物制品檢定所；有機化學試劑均為國產分析純試劑；新鮮奶牛乳房皮膚。

1.2 主要儀器 UV－2000紫外可見分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司），RE－5298旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），DHP－9162電熱恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司），BS210S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司），DL－360B智能超聲清洗器（上海之信儀器有限公司）。

1.3 中藥提取制備 按中醫藥組方原則將黃芪、當歸、蒲公英、大黃、連翹、瓜蔞、金銀花、芙蓉花等進行組方。準確稱取復方100g，用50%乙醇浸泡30min（料液比10∶1），然后超聲15min，回流提取2h，多層紗布過濾。藥渣再加50%乙醇（料液比8∶1），回流提取1h，多層紗布過濾，合并濾液，旋轉蒸發至無醇味，加入石油醚萃取，水相濃縮至2g／mL，121℃流通蒸汽滅菌15min。滅菌后4℃保存備用。

1.4 離體奶牛皮膚的制備［5］取新鮮奶牛乳房皮膚，用8%硫化鈉溶液去毛，剝離皮下脂肪及黏液組織，選取完整皮膚，用生理鹽水洗凈，浸于生理鹽水中，4℃冰箱短期保存，備用。

1.5 正交設計中藥透皮劑的制備 透皮劑為O／W型乳膏劑，根據文獻［5］將基質配方（A）、乳化劑（B）、溫度（C）作為可變因素進行考察，每個因素各取3個水平，選用L9（34）正交表進行試驗。按表1所列量取硬脂酸、單硬脂酸甘油醋、液體石蠟、凡士林、羊毛脂共置同一容器中，水浴加熱；將三乙醇胺、中藥液28.5mL放入另一容器中，水浴加熱，然后在等溫條件下將兩相混合，并不斷攪拌10min，加入促進劑（5%氮酮和10%丙二醇）。再于室溫條件下攪拌至冷凝，攪勻，制得中藥透皮劑。分別取各中藥透皮劑5g于離心管內，以3 500r／min離心，觀察中藥透皮劑分層時間，作為穩定性考察定量指標。另取上述配制的中藥透皮劑各10g，于具塞玻璃瓶中密閉，根據客觀情況，按膏劑的性狀：分散度、軟硬度、粘性等分類打分，所得總分越高，膏體性能越好。評分標準為：分散度（分散均勻即色澤一致3分、分散較均勻2分、分散差1分），軟硬度（軟硬適中3分，較軟或較硬2分、太軟或太硬1分），粘性（粘性適中不粘手3分、粘性較差粘手2分、粘性過強或過弱1分），根據中藥透皮劑分層時間及性能兩項指標，篩選最佳制備方案。

1.6 中藥透皮劑的穩定性試驗 取中藥透皮劑10 g，放入帶刻度離心管中，3 000r／min離心30min，進行離心試驗，觀察中藥透皮劑是否有分層及破乳現象。另取中藥透皮劑10g置于具塞試管內，分別置45℃恒溫箱6h或－20℃冰箱24h，進行耐寒耐熱試驗，檢查中藥透皮劑是否有分層破乳以及色澤、均勻性改變等現象。再取中藥透皮劑10g裝入具塞試管內，置于溫度為40℃±2.0℃，相對濕度為75%的恒溫培養箱中，連續放置3個月，進行加速試驗，定期檢查，觀察是否有分層破乳、霉敗以及色澤、均勻性改變等現象。

表1 透皮劑制備試驗因素水平表

1.7 中藥透皮劑體外透過率的測定 采用紫外分光光度法［6］進行，準確稱取綠原酸標準品5.0mg，用30%甲醇溶解并定容于50mL容量瓶中。再準確量取標準溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL分別加入刻度試管中，用30%甲醇溶液調至10 mL。于紫外分光光度計324nm處，測定其吸光度值（OD324值），重復3次，取平均值。以綠原酸標準品濃度為橫坐標，以其吸光度值（OD324值）為縱坐標繪制標準曲線。

自制透皮擴散池，內徑為1.8cm，接受池為6 mL，試驗溫度為37℃±2℃，攪拌速度為100r／min。釋放池一端用離體牛皮覆蓋，用縫合線扎緊，使皮膚角質層朝向管內，在管內加中藥透皮劑1g（試驗組）或未加促進劑的中藥透皮劑（對照組）1g，接受池內加生理鹽水6mL，使牛皮與接受液面接觸，在37℃±2℃條件下，連續攪拌，分別于加樣后1、2、4、6、8h取樣1mL，紫外分光光度法檢測綠原酸的透過量。每次取樣后補加生理鹽水1mL，重復3次，最后取平均值。并計算出每組各個時間點的累計透過量Q。按公式1計算累積透過量（Q），以累積透過量Q對時間t進行線性回歸所得方程即為y＝k＋t＋b，其中斜率k即為透皮速率常數j（μg／cm2·h），用j來評價中藥透皮劑透過效率。k按公式2計算。

式中，Cn：第n個取樣點測得的藥物濃度（μg／mL）；Ci：第1個取樣點測得的藥物濃度（μg／mL）；A：滲透面積（2.8cm2）。

式中，SPty為乘積和，是自變量t的離均差與依變量Q的離均差的乘積和，SSt為自變量t離均差平方和。

2 結果

2.1 中藥透皮劑的制備 綜合中藥透皮劑分層時間和性能，由方差分析可見，A、B、C對試驗指標的影響不顯著（P＞0.05）。但對其影響順序為A＞C＞B，即處方基質用量＞溫度＞乳化劑用量。綜合離心分層時間、分散度、軟硬度、黏性指標，得出透皮劑最佳工藝為A2B1C2，即油相取硬脂酸12g、單硬脂酸甘油酯3.5g、羊毛脂5g、凡士林2g、石蠟6 mL；水相取三乙醇胺0.3mL，中藥液28.5mL；在80℃時將兩相混合不斷攪拌10min，取出再于室溫條件下攪拌即得。

2.2 中藥透皮劑的穩定性 配方A2B1C2的中藥透皮劑的離心試驗、耐寒耐熱試驗和加速試驗結果顯示，其具有良好的穩定性，未發現分層、破乳、霉敗及色澤、均勻性改變等。

2.3 中藥透皮劑體外透過率的測定 將綠原酸標準溶液配制成系列濃度經測定后，以吸光度值（OD值）為縱坐標，綠原酸的含量為橫坐標，求得標準曲線方程為y＝57.463x＋0.0491，R2＝1，說明綠原酸的質量濃度為0.005～0.03mg／mL時，用本方法檢測具有良好的線性。

將1、2、4、6、8h時間點所測得的 OD值代入上述標準曲線方程，求得各點的綠原酸的透過量。按公式1計算累積透過量，按公式2計算透皮速率常數。可以看出，加5%氮酮和10%丙二醇的試驗組的透皮速率常數為15.1μg／cm2·h，而對照組沒有加促透劑的透皮速率常數為9.51μg／cm2·h。結果見表2。

表2 綠原酸的累積透過量（μg）

3 討論

3.1 中藥透皮劑主要由藥物、基質和透皮吸收促進劑組成。目前常用的透皮劑的基質可分為油脂性基質、乳劑型基質和水溶性基質三類，其中藥物在乳劑型基質中的釋放、穿透、吸收速度最快，乳劑型基質可分為油包水（W／O）型與水包油（O／W）型兩類，而O／W型基質比W／O型基質藥物的釋放和穿透快，所以本中藥透皮劑的研制選用O／W型基質配方進行試驗。正交設計結果表明，處方基質用量、乳化劑用量、溫度均為不顯著因素。綜合離心時間、分散度、軟硬度、黏性指標，得出透皮制劑最佳工藝為A2B1C2，即取硬脂酸12g、單硬脂酸甘油酯3.5g、羊毛脂5g、凡士林2g、石蠟6mL；三乙醇胺0.3 mL，中藥液285mL；在80℃時將兩相混合不斷攪拌10min，取出再于室溫條件下攪拌即得，這一試驗結果為進一步制劑提供了良好的基礎數據。

3.2 透皮劑制備完成后應色澤均勻，質地細膩，有適當的黏稠性，易于涂布皮膚，無粗糙感，具有一定的相對穩定性。為此，通過耐寒耐熱試驗、離心試驗和加速試驗檢驗采用A2B1C2工藝制備的透皮劑的穩定性。結果顯示，采用該透皮劑具有良好的穩定性，各項穩定性結果均符合要求，對于有效期要求兩年的產品，在溫度37℃～40℃，相對濕度75%以上的條件下保存3個月，產品穩定，則可暫定為有效期兩年［7］。所以該中藥透皮劑的保質期暫可定為兩年。

3.3 藥物的透皮吸收主要是通過皮膚表面的藥物濃度與皮膚深層的藥物濃度差以被動擴散的方式透過角質層，皮膚角質層是藥物透皮吸收的主要屏障。目前一般添加透皮吸收促進劑氮酮和／或丙二醇的方法來解決這個問題，根據文獻報道［5］，我們選用添加5%氮酮和10%丙二醇兩種促進劑來增加藥物的透皮速率。由于中藥透皮劑為復方制劑，成分較多，結構復雜，有關其透皮特點的基礎研究比較困難，為此研究復方制劑的透皮效果一般以復方制劑中某種有效成分的透皮量作為評價指標［8］。本復方以金銀花為主藥，金銀花有效成分主要有綠原酸，所以本研究通過測定中藥透皮劑中綠原酸的體外透皮量，驗證含5%氮酮和10%丙二醇對中藥透皮劑的透皮效果。本試驗采用紫外分光光度法測定綠原酸的透過量，結果表明，透皮劑中綠原酸的透皮速率常數J為15.1μg／cm2·h，這說明該中藥透皮制劑具有明顯的透過作用。

［1］高純一，祁永鋒，丁營兵.公英散加味治療奶牛乳房炎［J］.中國獸藥科學，2001，2（6）：101－103.

［2］許瑾，孫彥河，楊春波，等.乳安注射液治療奶牛乳房炎的效果試驗［J］.黑龍江畜牧獸醫，2004（7）：56.

［3］張繼東，李淑芳，苑方重，等.奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定和中藥防治試驗［J］.中國獸醫雜志，2006，42（11）：32－33.

［4］張喜豐.中藥透皮劑對奶牛臨床型乳腺炎的藥效學研究［D］.哈爾濱：東北農業大學，2007.

［5］葉剛.純中藥透皮劑“乳炎克”的研制及初步藥效學實驗研究［D］.成都：四川農業大學，2006.

［6］烏蘭，張澤生.金銀花中綠原酸的提取及檢測［J］.食品科學，2005，26（6）：130－138.

［7］Feldman E G.Consistency in Stability Testing［J］.Pharm sci，1979（68）：1.

［8］張愛華，王純明，付太招，等.HPLC法測定蒲公英及保肝奶薊草膠囊中咖啡酸的含量［J］.南京中醫藥大學學報：自然科學版，2002，18（5）：298－299.