致病性大腸埃希氏菌脈沖場凝膠電泳圖譜的建立

張 媛，李 建，彭小兵，劉軼秋，王 楠，李旭妮

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

細菌分型的目的是分析流行病學上相關的菌株是否來源于單一親代菌株的克隆擴增，區別于流行病學上無關菌株的特征構成了分型的依據[1]。一種理想的分型方法應是高分辨率、可重復性、標準化、快速簡便、價格低廉、良好的分型(指某種分型方法對病原體分析可得到陽性結果的能力)，并已成功地用于流行病學調查[1-2]。脈沖場凝膠電泳(Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE)是一個具有高重復性和高分辨率的細菌分子定型的工具，現已成為分子流行病學研究技術上的“金標準”[3]。1996年，美國疾病控制中心和公眾健康實驗室協會建立了脈沖網，用于監測食源性微生物。2004年9月，由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所牽頭，在北京成立了中國脈沖網。該監測網絡為跨地區病例的病原分析提供了比較平臺，便于快速比對搜尋分子分型上一致或高度相似的型別，從而為發現傳播流行和溯源提供線索和提示。中國脈沖網主要收錄的是人類病原微生物的脈沖圖譜，對于動物病原微生物的流行病學調查許多工作者也在采用PFGE的方法進行研究，但還沒有形成規模化的網絡。

大腸埃希氏菌病是一類重要的人畜共患病，在國內外均普遍發生，對養豬業危害極其嚴重，可分為仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病等病型。《中國獸醫菌種目錄》中收錄的致病性大腸埃希氏菌，其背景資料涵蓋菌株歷史(包括菌株來源、別號、原學名及菌株的分離)，菌株的主要特性(包括菌株的毒性、毒力、抗原性、免疫原性、培養特性、模式株或參考株、血清型等)，菌株的用途(包括用于制造疫苗、檢驗疫苗等)，參考文獻，培養基及生長條件等，但是沒有涉及菌株基因分型的數據。本研究利用PFGE方法建立了《中國獸醫菌種目錄》收錄的127株致病性大腸埃希氏菌的電泳圖譜，完善了《中國獸醫菌種目錄》中致病性大腸埃希氏菌背景資料，使其具有更大的參考價值，也為進一步探討大腸埃希氏菌基因分型與血清學分型及菌株致病性之間的對應關系提供了有意義的數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 致病性大腸埃希氏菌 127株致病性大腸埃希氏菌，由中國獸醫微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.2 質控菌株 大腸桿菌ATCC18785，由中國獸醫藥品監察所提供。

1.1.3 培養基 普通肉湯培養基、麥康凱瓊脂培養基，由中國獸醫藥品監察所提供。

1.1.4 試劑 低熔點瓊脂糖(Seakem Gold瓊脂糖)、蛋白酶 K、限制性內切酶(XbaⅠ酶，10 U/μL)、10 ×H Buffer，購自美國 Promega 公司。三羥甲基氨基甲烷(Tris base)、十二烷基肌氨酸鈉(N-Lauroyl Sarcosine sodium)、十二烷基硫酸鈉(SDS)購自Amresco公司。溴化乙錠儲液(EB，10 mg/mL)購自北京鼎國生物技術有限公司。HCl、Na2EDTA·2H2O、NaOH、硼酸，均為國產分析純。

1.1.5 主要儀器設備 GNP-9270型隔水式恒溫培養箱、DKB-8A型電熱恒溫水槽，購自上海精宏實驗設備有限公司。CHEF-DR III型脈沖電泳儀、凝膠成像系統，購自美國Bio-Rad公司。PHSJ-4A型實驗室pH計，購自上海雷磁儀器廠。電子天平購自北京賽多利斯儀器系統有限公司。THZ-C型恒溫振蕩器購自太倉市實驗設備廠。紫外分光光度計購自美國Beckman公司。Herasafe KS生物安全柜購自德國Heraeus公司。移液槍購自法國Gilson公司。

1.2 方法

1.2.1 制備細菌懸液 開啟菌種，在麥康凱瓊脂平皿上劃線培養。刮取細菌，懸濁于CSB中。測定610 nm處OD值，調整濃度至1.4～1.5。

1.2.2 制備膠 在調整好菌液濃度的每個試管中加入10 μL蛋白酶K儲存液(20 mg/mL)，每個菌液均吸出200 μL加到離心管中，向加有菌液的離心管中加入200 μL已融化的含1%Seakem Gold瓊脂糖及1%SDS的TE。混勻后加到模具中，將膠放在室溫10～15 min以使其凝固。

1.2.3 裂解膠 每個樣品需使用5 mL CLB，每5 mL CLB加入25 μL蛋白酶K儲存液(20 mg/mL)，每個試管中均加入5 mL此混合液，將每個樣品制備的膠移入相應的試管中，確保膠塊在液面下。在54℃搖床中孵育2 h，轉速200 r/min，裂解完成立即洗膠。

1.2.4 洗膠 每個管中加15 mL預熱的純水，置50℃搖床中振蕩15 min(200 r/min)。將水倒掉，每個管中再加15 mL預熱的純水，置50℃搖床中振蕩30 min(200 r/min)。將水倒掉，每個管中加15 mL預熱的TE，置50℃搖床中振蕩15 min(200 r/min)。再用TE重復洗3次，一共用TE洗4次。將TE倒掉，把膠移到裝有2 mL室溫TE的試管中，置4℃存放。

1.2.5 酶切 用刀片將膠的邊緣裁直后切成4～4.5 mm厚的膠層，將膠層放到裝有200 μL 1×H Buffer的離心管中，確保膠層在液面下，置37℃孵育10 min后，將緩沖液吸出。每個管中加入200 μL酶切溶液(174 μL 純水，20 μL 10 ×H Buffer，4 μL XbaⅠ酶，2 μL BSA)，37 ℃孵育4 h后置4 ℃存放。

1.2.6 加樣 將離心管底的緩沖液吸出，加入200 μL 0.5×TBE Buffer，室溫孵育5 min后，把膠塊加在梳子齒上，室溫下風干10 min。把梳子放入膠槽，倒入100 mL融化的54℃ 1%Seakem Gold瓊脂糖，室溫下凝固30 min。移走梳子，在膠孔中倒入融化的54℃ 1%Seakem Gold瓊脂糖，凝固5 min。

1.2.7 電泳 0.5×TBE Buffer制冷至14℃，取出凝固好的膠放入電泳槽，設置電泳條件為:角度120°，脈沖切換時間為2.2～54.2 s，電泳時間19 h，電壓6 V/cm，溫度14℃。

1.2.8 染色、脫色、拍照 400 mL純水中加入25 μL EB(10 mg/mL)對膠塊震蕩染色30 min(40 r/min)，再用400 mL純水震蕩脫色30 min，再重復脫色1次，拍攝圖像。

1.2.9 分析 將結果用Bio-Rad公司的Info Quest FP聚類分析軟件進行分析。

2 結果

2.1 127株致病性大腸埃希氏菌脈沖場凝膠電泳圖譜的建立 圖1為部分大腸埃希氏菌經PFGE分離，EB染色后的圖譜。圖1中大腸埃希氏菌的背景信息如表1所示。用Info Quest FP分析軟件對電泳結果進行分析，用10～3000 Kb的標尺表示出每株大腸埃希氏菌DNA條帶的位置，部分大腸埃希氏菌軟件分析結果見圖2。將分析結果輸入《中國獸醫菌種目錄》相應菌株的背景資料中，部分大腸埃希氏菌目錄如圖3所示。

圖1 部分大腸埃希氏菌的PFGE結果

表1 部分致病性大腸埃希氏菌背景信息

圖3 部分大腸埃希氏菌目錄

2.2 127株致病性大腸埃希氏菌脈沖場凝膠電泳結果分析 用聚類分析軟件對127株大腸埃希氏菌電泳結果進行分析，分析結果以百分比率的形式展示出來，百分比越大說明不同菌株之間的親緣關系越近;反之親緣關系越遠。Tenover等[4]認為由于細菌具有變異性，在PFGE圖譜分析中相似率在85%以上的菌株可以判斷是流行病學相關。從表2可以看出，流行病學相關的致病性大腸埃希氏菌O抗原、K抗原、H抗原血清型均相同;采樣部位相同;致病性相同。但O抗原、K抗原血清型均相同的大腸埃希氏菌流行病學不一定相關，如從西寧分離的CVCC227和江蘇農科院送藏的CVCC226血清型均為O8∶K87，K88ac，但PFGE電泳圖譜相似率只有75.8%。血清型不同的大腸埃希氏菌流行病學不相關。

表2 流行病學相關的致病性大腸桿菌比較

3 討論

《中國獸醫菌種目錄》對獸醫科研工作者、教學人員和有關工廠的技術人員在選擇利用微生物資源時有直接助益，對國際間交流起著橋梁作用。目前《中國獸醫菌種目錄》收錄的致病性大腸埃希氏菌背景資料中已經提供了菌株的血清學分型結果，但缺少基因分型數據。本課題組將127株致病性大腸埃希氏菌的條帶分子大小補充進《中國獸醫菌種目錄》相應菌株的背景資料中，使其具有更大的參考價值。

曾對15種O抗原血清型的健康豬大腸埃希氏菌分離株與其相同血清型的大腸埃希氏菌致病株的脈沖場凝膠電泳圖譜進行聚類分析，結果表明任何相同血清型的健康豬大腸埃希氏菌分離株和大腸埃希氏菌致病株沒有流行病學相關性。這個結果提示，大腸埃希氏菌脈沖場凝膠電泳圖譜很可能與其致病性有關[5]。

大腸埃希氏菌O抗原血清型鑒定在診斷和流行病學調查中被廣泛應用。本研究對127株致病性大腸埃希氏菌脈沖場凝膠電泳圖譜聚類分析結果表明，O抗原血清型相同的菌株流行病學不一定相關，但流行病學相關的菌株O抗原血清型一定相同。這個結果一方面說明了基因分型比表型分型更細致，同一表型的菌株又可劃分為不同的基因型;另一方面也在提示大腸埃希氏菌脈沖場凝膠電泳圖譜與致病性之間的相關性。大腸埃希氏菌的致病性除與O抗原有一定關系外，主要還取決于K抗原。K抗原是菌體表面的一種熱不穩定性抗原，多存在于被膜或莢膜中，個別位于菌毛中。致病性大腸埃希氏菌除含酸性多糖K抗原外，還含有蛋白質粘附素抗原，粘附素是大腸埃希氏菌致病的主要毒力因子[6]。但致病性不是決定脈沖場凝膠電泳圖譜的唯一因素，因為研究結果表明O抗原、K抗原血清型及致病性均相同的大腸埃希氏菌流行病學不一定相關。

本研究127株大腸埃希氏菌脈沖場凝膠電泳圖譜收錄于《中國獸醫菌種目錄》中，可供研究者進行比對，盡管不能像脈沖網中的數據進行電子比對，但康梅等[7]提供了一個人工比對的標準，即酶切圖譜差異3個條帶以上者為不同類型，3個條帶及以下者為同一型的不同亞型。認為同一型的各亞型間在基因上有相關性，而不同類型的菌株在流行病學上無相關性。如果分離株與《中國獸醫菌種目錄》中收錄的菌株為同一型，可能具有相同的致病性。實驗室間進行圖譜的比對必須保證使用相同的方法、試劑、儀器及電泳條件。

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[3]Pfaller M A，Wendt C，Hollis R J，et al.Comparative evaluation of an automated ribotyping system versus pulsed-field gel electrophoresis for epidemiological typing of clinical isolates of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa from patients with recurrent gram-negative bacteremia[J].Diagn Microbiol Infect Dis，1996，25:1-8.

[4]Fred C Tenover，Robert D Arbeit，Richard V Goering，et al.Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis:criteria for bacterial strain typing[J].Journal of Clinical Microbiology，1995，33(9):2233-2239.

[5]張 媛.規模化豬場80株大腸桿菌的耐藥性、血清型與脈沖場電泳分型[D].北京:中國農業大學，2011.

[6]De Graaf F K，Klemm P，Gaastra W.Purification，characterization，and partial covalent structure of Escherichia coli adhesive antigen K99[J].Infect Immun，1990，58:1858-1870.

[7]康 梅，申艷娜.脈沖場凝膠電泳在醫院內感染大腸桿菌的分子流行病學的應用研究[J].華西醫學，2002，17(1):34-35.