氯霉素化學發光酶聯免疫檢測方法的建立

何方洋，馮月君，吳 鵬，馮 靜，岳新榮，韓京朋

(北京勤邦生物技術有限公司，北京 102206)

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是20世紀中葉從委內瑞拉鏈絲菌中提取制得的一類廉價高效的廣譜抗生素[1-2]，對革蘭氏陽性和陰性細菌都有很好的抑制作用，因此一度被廣泛應用于農牧業中[3]。但是動物源性食品中的氯霉素藥物殘留隨著食物鏈被人體長期攝入，可引發各種危害和多種疾病。輕者破壞人體內正常菌群的平衡狀態，菌群失調，使人體產生耐藥菌珠，給以后患病使用抗生素治療帶來不良影響;氯霉素過敏體質的人會出現過敏反應，危及健康[4]。嚴重時可干擾骨髓細胞蛋白質的合成，并抑制幼稚細胞DNA合成，導致粒細胞減少，引發再生障礙性貧血、溶血、紫癱等惡性疾病[5]。氯霉素殘留問題對人類健康構成巨大的潛在威脅，已引起國際組織和世界上許多國家的高度重視[6]，歐美等發達國家均在法規中對CAP殘留限量標準作出了嚴格的規定[7]。我國農業部2001年公告第24號文件規定，在馬肝、雞肉等中氯霉素的殘留限量為不得檢出，要求其檢測限量為1 ng/g;2002年公告第235號文件進一步要求，氯霉素及其鹽、酯在所有食品動物的所有可食組織中不得檢出[8]。

為適應更高的檢測標準，檢測技術水平必須相應的提高，因此氯霉素檢測技術一直是近十年來國內外專家學者研究的熱門項目之一[9]。氯霉素的檢測方法分為物理化學法和免疫化學法，前者有液相色譜法(LC)、高效液相色譜法(HPLC)、質譜法(MS)等，后者主要是酶免法(ELISA)，檢測的靈敏度均達到ppb(μg/kg)級別[10-11]。當前主流的檢測方法是液相色譜法——我國行業標準所使用的方法以及ELISA。近幾年，國內外學者又研發出液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)、液相色譜電噴霧電離質譜法(LC-EITMS)、微生物分析等物理檢測新方法[12]，同時對ELISA方法的應用也有了進一步研究。

化學發光分析法是一種有效的微量和痕量分析法[13]，與放射免疫分析(RIA)和酶免疫分析(ELA)相比，RIA和ELA檢測時間一般為75～120 min，化學發光方法檢測時間一般為18 min，靈敏度與RIA屬于同一檢測水平，檢測限可達10-12～10-20mol[14-15]。獸藥殘留中的化學發光免疫分析，不僅具有免疫反應的特異性，而且具有化學發光分析的高靈敏性，如果能將兩項技術有效的結合起來，那么將會開啟一項十分有發展前景的分析監測技術。建立穩定的化學發光酶免疫分析方法，是進行化學發光試劑盒的研制的基礎，同時對于嚴把食品安全的檢驗環節有重要的意義。

1 材料

1.1 儀器與設備 電子天平2000SBL(美國Setra);磁力攪拌器90-2(上海振榮科學儀器有限公司);微量移液器，單道 20～200 μL、100～1000 μL，多道50 ～300 μL(美國Thermo);氮吹儀DSY-Ⅲ(北京金科精華苑科技有限公司);QL-901漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);低速離心機Anke TDL-40B(上海安亭科學儀器有限公司 );CentroLB960微孔板式發光儀(德國Berthold);Opti-plateTM化學發光板(Perkin Elmer);生化培養箱DHP-600(天津市中環實驗電爐有限公司)。

1.2 試劑 氯霉素及其類似物標準品(德國Dr.Ehrenstorfe公司);牛血清白蛋白 BSA、卵清蛋白OVA(Sigma公司);鹽酸、Pd/C催化劑、二甲基甲酰胺(DMF)、三丁胺、氯甲酸異丁酯、人糖化白蛋白(GA)(國藥集團化學試劑有限公司);辣根過氧化物酶 (美國Jackson公司);弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑(北京望爾生物技術有限公司);魯米諾發光底物液(Hyclone Pierce);其他有關化學試劑均為分析純。

2 方法

2.1 抗原的合成

2.1.1 免疫原的合成 將氯霉素溶于甲醇中，加入5%的Pd/C催化劑，通入氫氣，保持一定壓力，室溫反應2 h，過濾除去Pd/C，蒸干溶劑得到淡黃色黏稠液體，即得氯霉素半抗原。將上述得到的目標物在0～5℃下，用鹽酸調pH值為1～2，攪拌下滴加0.1～1 mol/L的NaNO2溶液，使淀粉碘化鉀試紙變藍，再滴加0.1～1 mol/L尿素溶液，使淀粉碘化鉀試紙變淺藍，再加0.1～1 mol/L的NaOH溶液調pH值為7～9，得到清液，作為溶液A備用。量取溶液A 21.8 mL加入DMF 3 mL中，4℃預冷10 min，加入三丁胺，混勻;并加入氯甲酸異丁酯，4℃攪拌20 min。稱取71.5 mg BSA溶于50%的DMF 10 mL中，4℃預冷。用1 mol/L NaOH調BSA的pH至8。將配制好的溶液A迅速加入BSA中，4℃攪拌反應4 h。取氯霉素半抗原30 mg用1.5 mL水溶解;取50%的GA 10 μL加入前述半抗原溶解液中，室溫下攪拌反應18 h;取BSA 100 mg用1.5 mL水稀釋后加入前述半抗原溶解液中;反應過夜后加入24 mg NaBH4反應3 h;用三蒸水透析48 h，即得免疫原[16]。

2.1.2 包被原的合成 按2.1.1步驟反應，取氯霉素半抗原30 mg，OVA 100 mg，合成CAP-OVA，供包被用。

2.2 單克隆抗體的制備 用上述制備出的免疫原(CAP-BSA)按150 μg/只，以生理鹽水溶解免疫復合物與弗氏完全佐劑等體積混勻，頸背部皮下注射免疫6～8周齡Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫復合物與弗氏不完全佐劑等體積混勻，各追加免疫1次，融合前3 d以免疫復合物100 μg/只，不加弗氏佐劑再追加免疫1次。按常規方法進行，取免疫小鼠的脾細胞與處于對數生長期的小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)混合，然后在45 s內緩慢加入預熱的融合劑(PEG4000)進行融合，用HAT培養基懸浮均勻，再加入適量的飼養細胞，培養于96孔培養板，37℃ 5%CO2培養箱中培養，5 d后用HT培養基半換液，9 d時候進行全換液，得到雜交瘤細胞，將2～3次亞克隆建株后的雜交瘤細胞擴大培養，收集上清液用間接ELISA測定效價，凍存;并取8～10周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.5 mL/只，7～10 d后腹腔注射雜交瘤細胞1×106～2×106/只，7～10 d后抽取小鼠腹水，離心取上清，測定效價，并凍存備用[17]。

2.3 酶標單克隆抗體制備 稱取5 mg辣根過氧化物酶溶于0.5 mL去離子水中，加入新鮮配制的0.06 mol/L NaIO4水溶液0.5 mL，混勻置冰箱30 min，取出加入0.16 mol/L乙二醇水溶液0.5 mL，于室溫放置30 min后加入含5 mg純化單克隆抗體的水溶液1 mL，混勻并裝透析袋對0.05 mol/L pH 9.5碳酸緩沖液緩慢攪拌透析6 h使之結合，吸出后加NaBH4溶液0.2 mL，置冰箱2 h。將上述結合物混合液加入等體積飽和硫酸銨，冰箱放30 min后離心，將所得沉淀物溶于少許0.02 mol/L pH 7.4 PBS中，并對之透析過夜，次日再離心除去不溶物，即得酶-抗體結合物，用0.02 mol/L pH 7.4 PBS加至5 mL進行測定后冷凍干燥保存。

2.4 氯霉素化學發光檢測方法的建立[18]

2.4.1 酶標板的制備 用包被緩沖液將氯霉素包被原稀釋成10 μg/mL，每孔加入 100 μL，37 ℃溫育2 h，傾去包被液，然后在每孔中加入150 μL封閉液，37℃溫育2 h，傾去孔內液體，用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗滌1次，拍干。

2.4.2 確定抗原抗體最佳稀釋比例 采用方陣滴定法確定包被原與單克隆抗體的最佳工作濃度。將包被抗原按 160.0、80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25 μg/mL的系列稀釋度包被酶標板，將酶標氯霉素單克隆抗體按 1 ∶1000、1 ∶2000、1 ∶4000、1 ∶8000、1 ∶16000、1 ∶32000、1 ∶64000、1 ∶128000、1∶512000的倍數進行稀釋，用方陣法確定抗原抗體的最佳稀釋比例。

2.4.3 氯霉素化學發光酶聯免疫方法標準抑制曲線的繪制 向用氯霉素偶聯包被原包被的酶標板微孔中加入濃度分別為 0、20.0、60.0、180.0、540.0和1620.0 pg/mL的氯霉素標準品溶液各50 μL，再加入酶標氯霉素單克隆抗體工作液50 μL，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜封板，25℃恒溫箱中反應15 min，倒出孔中液體，重復洗板5次，拍干。每孔加入化學發光顯色液100 μL，輕輕振蕩混勻，3 min后用微孔板式發光儀測定每個孔的發光強度。每個濃度的標準品溶液的發光強度平均值(RLU)除以第一個標準品溶液(0標準品)的發光強度值(RLU0)再乘以100%，得到百分發光強度值，以氯霉素標準品濃度(pg/mL)的半對數值(lgC)為橫坐標，百分發光強度值為縱坐標，繪制標準曲線圖。

2.4.4 檢測與其他藥物的交叉反應率 用于抗體交叉反應性研究的藥物均為與氯霉素結構或者功能相似的藥物。按試劑盒程序操作，但加入的競爭物分別為不同的氯霉素類似物，制作抑制曲線，根據線性方程計算各競爭物50%抑制濃度(IC50)。交叉反應率(CR%)即為抗體對氯霉素的IC50與抗體對競爭物的IC50之比的百分數，按下式進行計算:

2.4.5 豬肉中氯霉素殘留檢測 稱取(3.0±0.05)g去除脂肪的均質樣本至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入6 mL乙酸乙酯，用振蕩器振蕩10 min，4000 r/min，室溫(20 ～25 ℃)離心 10 min;移取4 mL上層有機相(約相當于2 g的樣本)至10 mL干凈玻璃試管中，于50～60℃水浴氮氣流下吹干;加入1 mL正己烷，用渦旋儀渦動30 s，再加1 mL磷酸鹽緩沖液，用渦旋儀渦動1 min轉入2 mL離心管中，4000 r/min，室溫(20～25℃)離心15 min;除去上層有機相，取下層50 mL用于分析。

2.4.6 最低檢測限、回收率及精密度 取20份空白樣品，按照2.4.5項步驟處理后所建立的ELISA方法進行檢測。通過標準曲線計算對應的濃度。以20份空白樣品對應的樣品濃度平均值加上3倍標準差作為樣本檢測的最低檢測限。

另取氯霉素標準品分別對豬肉樣品按照10、20 pg/g進行添加回收試驗。分別抽取3個批次試劑盒進行檢測，每個濃度做6個重復，每個樣品2個平行，計算準確度及精密度。

3 結果

3.1 包被抗原及HRP-CAP單抗最佳稀釋倍數經方陣滴定法確定包被抗原濃度為10 μg/mL，HRP-CAP單抗稀釋倍數為1∶16000時，試驗效果較理想(R2=0.9948、IC50=59.911 pg/mL)，因此，確定抗原包被濃度為10 μg/mL，HRP-CAP單抗的稀釋倍數為1∶16000。

3.2 競爭反應時間優化 按上述實驗方法加入標準品和標記抗體后測定室溫下反應10、15、20以及25 min后加入發光溶液，測定0標準品的發光值，結果表明在反應15 min時發光值最大(圖1)，因此本試劑盒選取反應時間為15 min。

圖1 反應時間與發光強度的關系

3.3 標準工作曲線 氯霉素化學發光酶聯免疫檢測試劑盒的標準工作曲線見圖2，IC50值為59.911 pg/mL，線性范圍為20～1620 pg/mL。

圖2 氯霉素試劑盒標準工作曲線

3.4 試劑盒特異性 氯霉素單克隆抗體對其類似物的交叉反應率見表1。可以看出，該單克隆抗體對其他幾種類似物的交叉反應率均較低，其對氯霉素具有較好的特異性。

表1 氯霉素試劑盒特異性試驗

3.5 最低檢測限 對20份空白豬肉樣本進行檢測，測定結果的平均值加上3倍標準差為該方法對實際樣本的最低檢測限，結果見表2。由表得出空白豬肉樣品平均值為2.65 pg/g，標準差為2.20，最低檢測限為9.3 pg/g。

表2 該方法對豬肉的最低檢測限 pg/g

3.6 準確度與精密度 ELISA法的準確度以回收率表示，精密度以變異系數來表示。取豬肉樣本分別添加氯霉素標準品至10、20 pg/g，對樣本進行添加回收試驗，分別計算準確度和精密度，檢測結果見表3。

表3 準確度和精密度試驗結果

4 結論

由于氯霉素是小分子物質，沒有免疫原性，所以必須連接到大分子載體上產生特異性免疫應答[19-20]，本試驗將氯霉素分別與牛血清白蛋白和卵清蛋白偶聯，合成免疫原和包被原[21-24]。本研究根據間接競爭反應原理建立快速檢測CAP的一步式化學發光酶聯免疫法，經進一步優化，其最佳反應條件為:抗原包被濃度為10 μg/mL，包被溫度為37℃，反應2 h，HRP-CAP單抗最佳稀釋倍數為 1 ∶16000，競爭反應15 min，洗滌液為 pH 7.4、含0.05%吐溫-20的PBST溶液。本研究所制備的單克隆抗體對氯霉素具有很高的特異性(IC50=59.911 pg/mL)，并且對氯霉素抑制標準曲線線性良好，對其他氯霉素類似物的交叉反應率較低，該試劑盒的線性范圍為20～1620 pg/mL，靈敏度為20 pg/mL，最低檢測限為10 pg/mL，樣本添加回收率在 76.3% ～94.7%之間，批內變異系數在3.1% ～8.7%之間，批間變異系數在6.0% ～6.2%之間，完全能夠滿足對于氯霉素殘留檢測的要求。

2002年1月，美國食品與藥品管理局(FDA)公布了禁止在進口動物源性食品中使用氯霉素;歐盟的進口食品衛生標準規定“氯霉素含量標準為不得檢出。”我國農業部也于2002年12月明文規定在所有動物的食品中不得檢出含有CAP及其鹽、酯等。其“不得檢出”的含義是氯霉素含量在1 ppb以下，即含量在十億分之一(ppb)級以下;德國部分州的特殊檢測標準為0.2 ppb。本試驗方法的各項指標均能滿足檢測要求。經檢驗，比常規ELISA的檢測效果更好，且可縮短反應時間約60 min。可見，以一步式化學發光酶聯免疫法檢測動物組織中的CAP殘留更符合快速檢測的要求，實現了對CAP殘留的簡便、快速、精確檢測。

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