豬流行性腹瀉病毒感染的診斷與病毒的初步分離

蔣 梅，楊澤曉，張榮昌，姚學(xué)萍，王 印

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安625014；2.西藏昌都地區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生及植物檢疫監(jiān)督所，西藏 昌都854000）

豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起哺乳仔豬腹瀉、嘔吐、脫水和高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病。自1971年首次在英國(guó)和比利時(shí)報(bào)道之后，日本、韓國(guó)、加拿大、中國(guó)等世界各國(guó)相繼報(bào)道了PED的發(fā)生［1－2］。該病對(duì)全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。PEDV屬于套式病毒（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronauiridae）冠狀病毒屬（Coronauirus），基因組核酸為單股正鏈RNA，有侵染性，長(zhǎng)約28kb［3］。病毒顆粒呈球狀，有囊膜和纖突，核衣殼呈螺旋狀對(duì)稱［4］。1988年瑞士的首次報(bào)道PED病毒在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)獲得成功之后，我國(guó)的學(xué)者也先后在PK－15、Vero、ST等細(xì)胞上進(jìn)行了該病毒分離的報(bào)道。

日前，四川省某豬場(chǎng)發(fā)生大規(guī)模的仔豬腹瀉性致死性的疾病，臨床癥狀水樣腹瀉或伴隨嘔吐（多發(fā)于吃食或吮乳后）、脫水；糞稀如水，呈灰黃色或灰色。少數(shù)病豬體溫升高1℃～2℃，精神沉郁，食欲減退或不食，尤其是繁殖種豬。該病豬年齡越小，臨床癥狀越重。本試驗(yàn)采集發(fā)病豬場(chǎng)病死豬的腸系膜淋巴結(jié)提取總RNA和DNA進(jìn)行了RT－PCR和PCR檢測(cè) ，并對(duì)引起該次大規(guī)模腹瀉的病料進(jìn)行了病毒的初步分離純化，為進(jìn)一步對(duì)該病的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料的采集 采集病死豬和發(fā)病豬的腸系膜淋巴結(jié)，以及脫落的腸黏膜用于進(jìn)一步的（RT－）PCR檢測(cè)和病毒分離。

1.2 主要試劑和引物 根據(jù)文獻(xiàn)［5］選擇的Vero細(xì)胞（由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)中心提供）來(lái)進(jìn)行病毒分離，DMEM（HyClone）營(yíng)養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶－EDTA消化液，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；RNAiso Plus、RT－PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自TaKaRa公司；Tap Mix，購(gòu)自博邁德科技發(fā)展有限公司，DNA Marker，購(gòu)自TIANGEN公司；DNA膠回收純化試劑盒，購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司；瓊脂糖，購(gòu)自BIOWEST公司；偽狂犬病病毒（PEV）、圓環(huán)病毒（PCV2）、細(xì)小病毒（PPV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸障礙病毒（PRRSV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的特異性引物分別根據(jù)參考文獻(xiàn)［6～12］，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；PEV、PCV2、PPV、CSFV、PRRSV、JEV 等病毒的陽(yáng)性血清，由本實(shí)驗(yàn)室自制并保存。

1.3 病毒RNA和DNA的提取及檢測(cè) 取病死豬和發(fā)病豬的腸系膜淋巴結(jié)，根據(jù)RNAiso Plus提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，DNA的提取參考文獻(xiàn)［13］采用酚－氯仿法。

1.4 豬源其他病毒的（RT－）PCR擴(kuò)增 以1.3步驟中所得到的cDNA和RNA作為模板，用PEV、PCV2、PPV、CSFV、PRRSV、JEV、PEDV 特異性的引物進(jìn)行（RT－）PCR擴(kuò)增。

1.5 病毒分離 取病死豬腸系膜淋巴結(jié)和已脫落的腸黏膜剪碎，置于研缽中，滴加5～10倍體積的生理鹽水，研磨20min，反復(fù)凍融3次后轉(zhuǎn)入EP管中加入青霉素（1 000IU／mL）、鏈霉素（300μg／mL）37℃水浴1h，之后經(jīng)4 000r／min離心30min，取上清用0.22μm的濾膜過(guò)濾之后用滅菌的EP管收集或直接取0.6mL接種在長(zhǎng)成單層的Vero細(xì)胞，每隔6～10h觀察細(xì)胞病變。

1.6 病毒純化 在Vero細(xì)胞上盲傳病毒至第25代之后在收集的病毒液里面加入PEV、PCV2、PPV、CSFV、PRRSV、JEV等病毒的陽(yáng)性血清，37℃溫育1h后繼續(xù)在Vore細(xì)胞上繼續(xù)傳代，收集病毒液，進(jìn)行豬源其他病毒RT－PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 病毒RNA和DNA的提取及檢測(cè) 獲取病料中核酸，經(jīng)PCR或RT－PCR后瓊脂糖電泳檢測(cè)，PEV、PCV2、PPV、CSFV、PRRSV、JEV 等病毒的核酸擴(kuò)增均為陰性，PEDV出現(xiàn)預(yù)期大小的陽(yáng)性條帶664bp，結(jié)果見(jiàn)圖1。PCR產(chǎn)物的序列測(cè)定結(jié)果顯示同源性98%～99%，判定PEDV核酸陽(yáng)性。

2.2 病毒的分離培養(yǎng) 用Vero細(xì)胞同步接毒后毒株在盲傳前5代時(shí)細(xì)胞都沒(méi)有發(fā)生明顯的病變，傳至第6代逐漸開(kāi)始有病變，等傳至25代以后細(xì)胞接毒24～32h出現(xiàn)了病變：細(xì)胞折光度降低、變圓、體積縮小、碎裂、細(xì)胞部分脫落見(jiàn)圖2。

2.3 病毒的純化 在第25代之后收集的病毒液里面加入PEV、PCV2、PPV、CSFV、PRRSV、JEV 等病毒的陽(yáng)性血清，37℃溫育1h后繼續(xù)在Vero細(xì)胞上傳代培養(yǎng)，同時(shí)取傳代細(xì)胞提取RNA和DNA做PCR或RT－PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，除PEDV擴(kuò)增出約664bp目的條帶外，其他病毒均為擴(kuò)增陰性見(jiàn)圖3。

圖3 病毒純化后做豬外源病毒檢測(cè)結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)從疑似PEDV的發(fā)病豬群的病死豬采集腸系膜淋巴結(jié)、脫落的腸黏膜等病變組織，采用RT－PCR進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，并進(jìn)行了PCR產(chǎn)物的序列測(cè)定，結(jié)果顯示，PEDV核酸陽(yáng)性，同時(shí)我們對(duì)PEV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV等常見(jiàn)病毒也進(jìn)行了檢測(cè)均為核酸陰性，結(jié)合其流行病學(xué)、臨床癥狀和抗生素治療效果不佳等方面，判定引起該次仔豬腹瀉大規(guī)模致死的病原為PEDV。同時(shí)本研究采用Vero細(xì)胞對(duì)其病毒進(jìn)行了初步分離，并經(jīng)過(guò)RTPCR檢測(cè)與PEDV擴(kuò)增目的DNA片段大小相符，為進(jìn)行一步PEDV防治的相關(guān)研究提供科學(xué)材料和參考依據(jù)。

對(duì)于 PEV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、JEV、PEDV等豬外源性病毒來(lái)說(shuō)，均可以采用猴腎細(xì)胞來(lái)進(jìn)行分離［14］，因此此次的病毒分離采用Vero細(xì)胞；病毒傳至第6代開(kāi)始出現(xiàn)病變，提示病毒已經(jīng)適應(yīng)了Vero細(xì)胞，可穩(wěn)定的增殖，傳代6次以后進(jìn)行外源病毒的陽(yáng)性血清中和試驗(yàn)應(yīng)該比較合適，同時(shí)發(fā)現(xiàn)傳至第25后代病毒在24h左右就已經(jīng)發(fā)生明顯的細(xì)胞病變，考慮到試驗(yàn)的可靠性，本研究收集第25代后細(xì)胞毒進(jìn)行（RT－）PCR檢測(cè)。為保證病毒的分離純化工作的順利進(jìn)行，本試驗(yàn)采用豬源病毒（PEV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、JEV）陽(yáng)性血清處理繼續(xù)傳代，一方面提高了病毒純化效率，大大縮短了分離純化病毒所需要的時(shí)間，另一方面排除PEV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、JEV 等病毒感染的可能。

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［14］第十章 常見(jiàn)的致動(dòng)物疾病性病毒［DB／OL］.http：／／www.doc88.com／p－28344541422.html.