牛外周血T淋巴細胞增殖試驗條件的優化

肖 進，王 楠，巴利民，齊 鵬

（中國牧工商（集團）總公司，北京 海淀100095）

淋巴細胞增殖試驗是體外檢測T淋巴細胞功能的一種方法。淋巴細胞在體外培養條件下，與特異性抗原或非特異性有絲分裂原共同培養，使淋巴細胞的代謝和形態發生一系列的變化，可以使較小的淋巴細胞轉化為體積較大、代謝旺盛，且能進行有絲分裂的淋巴母細胞。轉化的淋巴細胞不僅能呈現出成熟的母細胞形態及蛋白質和核酸的增加，還能合成和釋放細胞因子。因此可以使用淋巴細胞增殖試驗反映機體的免疫狀態［1］。

引起淋巴細胞增殖常用的刺激物大致分為特異性和非特異性兩種：非特異性刺激物主要有刀豆蛋白 A（ConA）、植物血凝素（PHA）、美洲商陸（PWM）、脂多糖（LPS）等；特異性刺激物主要有疫苗、組織抗原、抗血清等。其中PHA和ConA為促T細胞有絲分裂原，LPS為促B細胞有絲分裂原［2］。淋巴細胞受到抗原或有絲分裂原刺激發生轉化時，伴有DNA的大量合成，使淋巴細胞轉化成淋巴母細胞。用于檢測淋巴細胞增殖試驗的方法主要有3種，即形態學方法、H－胸腺嘧啶核苷（3H－TdR）摻入法和MTT法等。形態學方法簡便易行，不需要特殊設備，但受試驗條件變化差異較大，重復性和客觀性較差，也不適用于大批量的檢測。H－胸腺嘧啶核苷（3H－TdR）摻入法是體外淋巴細胞增殖試驗客觀性較好的方法，其結果客觀、準確、重復性好，但是需要一定的設備條件，而且存在放射性污染的危險，因此一般實驗室開展這方面的研究受到了限制。1983年 Mosmann T R［3］建立了四甲基偶氮唑（MTT）比色法，該方法簡便、迅速、準確、安全價廉，已經在生物學和醫學的許多研究領域中用于檢測細胞毒性、細胞活性和細胞增殖試驗。本試驗參考犬和雞等其他動物增殖試驗方法［4］，探討牛淋巴細胞增殖試驗的最佳試驗條件。

1 材料與方法

1.1 試驗用牛 挑選品種、來源相同，5月齡左右健康牛3頭。

1.2 試驗試劑 RPMI1640培養基（Gibco公司產品）；刀豆蛋白 A（ConA）（Sigma公司產品）；MTT（Ameresco公司產品）；胎牛血清（Hyclone公司產品）。配制分別含有5%、8%、10%胎牛血清的RPMI1640培養基（含有1%青、鏈霉素）。

1.3 方法

1.3.1 血液采集 使用無菌抗凝采血管分別采取3頭牛的頸靜脈血。顛倒混勻采血管，防止血液局部凝集。

1.3.2 分離淋巴細胞 取1份抗凝血，緩慢將其加至于2份的淋巴細胞分離液（購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）液面上，以2 000r／min離心20min。收集界面上的細胞層，加入5mL的Hank′s液（購自邁晨科技有限公司），充分混勻后，以2 500r／min離心20min，吸去上清液，沉淀用Hank′s液反復洗滌2次，最后用適量含有不同血清濃度的RPMI1640培養基將細胞分別稀釋成2×105個／mL、2×106個／mL、2×107個／mL待用。

1.3.3 淋巴細胞的培養 將稀釋為不同濃度的淋巴細胞分別加入至96孔細胞培養板中，每孔100 μL。將陽性刺激物ConA和陰性刺激物BSA分別過濾除菌，加20μL至培養板中，使二者終濃度分別為10μg／mL、2.5μg／mL；并設只有細胞不加刺激物的對照孔，只有培養基的本底孔；設5個重復，置于37℃，5%CO2分別培養48、60、72h。

1.3.4 MTT法檢測增殖結果 細胞經過培養后，每孔加入MTT溶液20μL，繼續培養4h。每孔加入DMSO150μL，稍振蕩待沉淀物溶解后，于酶標儀波長為570nm處測定OD值。按照如下公式計算SI指數。

SI＝（刺激物OD值－空白對照OD值）／（陰性對照OD值－空白對照OD值）

2 結果

2.1 細胞濃度的選擇 MTT法檢測T淋巴細胞增殖，細胞濃度在一定范圍內，MTT與活細胞線粒體脫氫酶相結合，形成的藍色沉淀與細胞數量呈正相關。細胞濃度在2×107個／mL時，顯微鏡下觀察細胞狀態差；細胞濃度為2×105個／mL時，細胞狀態良好，但是OD值與細胞濃度不存在線性關系；只有當T淋巴細胞數量在2×106個／mL時，顯微鏡下觀察細胞狀態良好，且OD值與細胞數量呈穩定的線性關系。因此確定分離培養的淋巴細胞濃度應使用2×106個／mL。

2.2 血清濃度的選擇 本試驗配制分別配制含有5%、8%、10%胎牛血清的RPMA1640培養基，分別對濃度為2×106個／mL的淋巴細胞進行培養，每個血清濃度的淋巴細胞分別培養48、60h和72h。經酶標儀在570nm處檢測其OD值，計算SI指數，結果如圖1所示。培養48h，隨著血清濃度的提高，SI指數逐漸上升，血清濃度10%時，其SI指數最高；培養60h，其SI指數總體比48h的SI指數高，且隨著血清濃度升高，其SI指數增大；培養72h，血清濃度為8%時SI指數最高。由此得出，當胎牛血清濃度為8%時，SI指數在60h和72h都很穩定，且數值較高，與10%濃度的SI指數沒有顯著區別，因此本著節約成本和降低本底的原則，確定胎牛血清最適濃度為8%。

2.3 培養時間的選擇 在血清濃度為8%時，培養不同時間的SI指數關系見圖2。隨著培養時間的延長，SI指數逐漸上升。由48h至60h升高明顯，由60h至72h升高不明顯。說明培養至60h其淋巴細胞增殖效果良好，增加培養時間并沒有使增殖明顯升高。因此為了節省培養時間、降低成本，確定培養60h為最佳培養時間。

3 討論

3.1 細胞濃度對增殖試驗的影響 增殖反應的細胞應保持高活性，細胞濃度在一定范圍內與OD值顯示出較強的正相關，細胞濃度過高或過低，都不能正確反映細胞代謝情況，不利于細胞生長。劉民［5］等對小鼠脾臟淋巴細胞和胸腺淋巴細胞進行培養，發現脾臟淋巴細胞和胸腺淋巴細胞最佳應用濃度分別為1.5×106個／mL和3×106個／mL。馬亞萍［6］等進行試驗發現，小鼠脾淋巴細胞最佳培養濃度為1×106個／mL。林忠寧等［7］使用 MTT法進行T淋巴細胞增殖試驗時對細胞濃度進行選擇發現，當細胞在1×106個／mL～10×106個／mL范圍內，隨著濃度增高，OD差值逐漸增高，二者呈明顯正相關（P＜0.01）。孔慶波［8］等培養犬外周血淋巴細胞確定細胞濃度5×106個／mL為最佳。

3.2 血清濃度對MTT法檢測淋巴細胞增殖能力的影響 胎牛血清能促進淋巴細胞增殖，因此在淋巴細胞培養時被廣泛使用，一般使用濃度為5%～10%［9－10］。當血清濃度超過10%時，OD值反而下降，原因可能是高濃度血清對淋巴細胞具有毒性作用。還有一種原因是高濃度血清可能會影響試驗孔的光吸收值。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養液進行試驗。

3.3 細胞培養時間對MTT法檢測淋巴細胞增殖能力的影響 活化T細胞的有絲分裂使具有相同抗原特異性的細胞克隆得到擴增，從而大大增強了對特定抗原的免疫應答。T細胞經過TCR復合物刺激后，其有絲分裂活性可在體外培養48～72h后檢測到。林忠寧等［7］培養小鼠、SD大鼠脾臟和人外周血淋巴細胞發現48h為最佳培養時間。郭松林等［10］認為培養鴨外周血淋巴細胞66h最優。孔慶波等［8］培養犬外周血淋巴細胞68h。本試驗在48、60、72h3個時間下對細胞進行培養，以研究培養時間對淋巴細胞增殖的影響。結果表明，在相同條件下，60h培養效果最佳。

通過本試驗得到牛外周血T淋巴細胞增殖試驗的最佳條件為2×106個／mL的細胞，8%的胎牛血清濃度及60h的培養時間。

［1］章靜波.組織和細胞培養技術［M］.北京：人民衛生出版社，2002.

［2］薛慶善.體外培養的原理與技術［M］.北京：科學出版社，2001.

［3］Mosmann T R.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival application to proliferation and cytotoxicity assays［J］.Journal of Immunological Methods，1983，65：55－63.

［4］Landsman T，Leitner G，Robinzon T B，etal.Effect of Gonadal Sterids on Proliferative Responses and Subset A lterations in Cultured Chicken Lymphocytes［J］.Poultry Science，2001，80（9）：1329－1338.

［5］劉民，馬華，李柏青.MTT法檢測小鼠淋巴細胞增殖性反應探討［J］.中國實驗動物學雜志，1999（3）：146－149.

［6］馬亞萍，白劍英.MTT法探討N－乙酞半膚氨酸對Na2S03小鼠脾淋巴細胞毒性的影響［J］.山西醫科大學學報.2006（10）：1020－1021.

［7］林忠寧，董勝璋，董書蕓，等.MTT法檢測T淋巴細胞增殖功能的方法學探討與應用［J］.中國衛生檢驗雜志，2000（1）：8－10.

［8］孔慶波，劉劍郁，常建軍，等.犬淋巴細胞轉化增殖試驗最佳條件的確定［J］.畜牧獸醫科學，2007（7）：47－49.

［9］王遠閣，崔保安，張紅英，等.黃芪板藍根等多糖成分對雞淋巴細胞體外增殖的影響［J］.河南農業大學學報，2007，41（2）：196－199.

［10］郭松林，關瑞章，馮建軍.歐洲鰻魚淋巴細胞轉化試驗條件的建立［J］.中國水產科學，2007，14（3）：403－410.