牛分枝桿菌特異性多重PCR反應在臨床樣本檢測中的應用

王春芳，于 丹，王 建，錢愛東

（1.吉林農業大學動物科技學院，吉林 長春130118；2.長春市動物疫病預防控制中心，吉林 長春130000）

牛結核病主要是由牛分枝桿菌引起的慢性肉芽腫性疾病，主要感染動物的淋巴結和肺臟。在基因組水平上，牛分枝桿菌和結核分枝桿菌同源性達到99.95%［1］。不同生態型的牛分枝桿菌都具有非常廣的感染范圍。獾、鹿、哺乳動物以及一些自由生活的物種都能感染牛分枝桿菌。牛和牛之間的傳播可能是最重要的傳染途徑［2］。

牛結核病的傳統診斷方法主要是應用結核菌素（PPD）皮試，該方法成本低、應用簡單，但缺乏靈敏度和特異性。對牛分枝桿菌的培養具有低靈敏度、耗時、費力等缺點。因此，建立快速、可靠地檢測牛分枝桿菌的方法對于控制牛結核病就顯得尤為重要。聚合酶鏈反應（PCR）具有靈敏、特異、快速等特點，已被用于牛結核病的流行病學調查［3－6］。

研究證實，在牛分枝桿菌recA基因中，存在兩個內蛋白插入位點：recA－a和recA－b。在recA－a位點，存在一個1 320bp的內蛋白，該內蛋白只存在于牛分枝桿菌和結核分枝桿菌中，在其他分枝桿菌中并不存在此內蛋白，因此該序列可被用于PCR診斷的靶序列［7－10］。IS6110和IS1081均是結核分枝桿菌復合體（MTBC）中共有的插入序列。IS6110是一功能性轉座子，在牛分枝桿菌中存在1～5個拷貝［11－12］。IS1081在 MTBC中存在6個拷貝［13］。因此，本研究應用已建立的三重PCR反應IS6110－IS1081－recA［14］檢測牛全血中的牛分枝桿菌，為研究新型診斷試劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑EXTaqDNA聚合酶、核酸分子量標準DL－2 000、dNTPs和pMD18－T載體，均購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收純化試劑盒，購自杭州維特潔生化技術有限公司；全血基因組DNA提取試劑盒，購自北京索萊寶生物技術有限公司。

1.2 樣本 自某屠宰場采集256份血液樣本，每份血液樣本采集兩份，其中1份離心分離血清用于間接ELISA檢測，應用建立的三重PCR反應檢測另外1份血液樣本。

1.3 牛全血基因組DNA提取及特異性基因的PCR擴增 應用北京索萊寶生物技術有限公司的全血基因組DNA提取試劑盒提取牛全血基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，應用已構建的三重PCR反應進行PCR擴增［14］。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4 recA、IS6110和IS1081基因PCR產物的純化及序列分析 在T4DNA Ligase的作用下，純化的PCR產物與pMD18－T載體進行連接，構建重組質粒pMD18－T－6110，pMD18－T－1081，pMD18－T－recA。陽性重組子由上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，應用BLAST進行序列分析。

2 結果

2.1 牛全血樣本PCR檢測結果 應用間接ELISA和多重PCR反應檢測采集的256份血液樣本。結果發現，其中2份（25號和32號）血液樣本ELISA檢測結果和PCR檢測結果均呈陽性（見圖1）。

2.2 牛分枝桿菌特異性基因的序列分析 在T4 DNA Ligase的作用下，純化的PCR產物與pMD18－T載體進行連接，構建重組質粒pMD18－T－6110，pMD18－T－1081，pMD18－T－recA。每 個 陽 性重組子分別取4個菌落進行序列分析。結果發現，牛分枝桿菌特異性基因IS6110，IS1081和recA與M.bovisAF2122／97株的同源性均達到99%以上，結果見表1所示。

圖1 牛全血多重PCR檢測電泳圖譜

表1 牛分枝桿菌特異性基因的同源性比較

3 討論

牛結核病主要是由牛分枝桿菌引起的一種人獸共患慢性傳染病。近年來，由于有效診斷方法的缺失使牛結核病嚴重流行，因此建立快速可靠的檢測方法就成為研究熱點。聚合酶鏈式反應具有靈敏、特異等特點，可用于牛分枝桿菌檢測。2007年，Taylor等［15］建立了IS1081特異性PCR反應，對淋巴結有明顯病灶的牛進行檢測，結果檢測的敏感性可達 到 2.35fg DNA。Ben 等［16］應用建立的IS6110PCR反應檢測339份肺組織樣本，敏感性和特異性分別達到93.8%和98.6%。與牛分枝桿菌培養和鑒定的漫長過程相比較，PCR方法僅需1～2 d即可明確診斷，具有很大的潛在臨床應用價值。本試驗建立的recA－IS6110－IS1081三重PCR反應，可做為M.bovis和結核分枝桿菌快速檢測和流行病學調查工具，應用該方法診斷結核病將具有非常重大的意義。

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