豬傳染性胃腸炎病毒NC株的分離鑒定及生物學特性試驗

鐘 望，田 野，牛曉蕓，王艷麗，張顯浩，陳瑞愛，，賀東生，

（1.華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東 廣州510642；2.廣東省生物制品技術研究與應用企業(yè)重點實驗室，廣東 肇慶526238）

豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）屬冠狀病毒屬成員，只有一個血清型，是引起豬傳染性胃腸炎（TGE）的病原。TGE是豬的一種急性高度接觸性傳染病，主要引起2周齡以內的仔豬嚴重嘔吐、腹瀉、脫水和高死亡率（可達100%）。1945年，美國的Doyle和HutChings首次報道TGE的存在，現(xiàn)在本病已廣泛存在于歐洲、美洲、亞洲各國，20世紀60年代首次在我國豬群中發(fā)現(xiàn)該病，在我國該病主要以暴發(fā)性和地方流行性兩種形式發(fā)生，2010年以來流行情況及危害程度日趨加深［1－2］。

TGEV主要編碼的結構蛋白有纖突蛋白（S）、膜結合蛋白（M）、核蛋白（N）和小膜蛋白（sM）4種，其中N蛋白高度保守，這為以N蛋白作為該病的診斷提供了理論基礎，N蛋白在TGEV的復制和轉錄過程中也發(fā)揮重大作用，同時影響病毒的致病性［3－4］。

本試驗從華南地區(qū)某豬場疑似感染TGEV豬群中采集典型發(fā)病豬肛拭子，經處理后通過血凝（HA）及血凝抑制（HI）試驗、中和試驗、TCID50測定及RT－PCR檢測和序列分析等方法進行鑒定。同時，本試驗的TGEV血凝特性不同于國內一些專著中TGEV沒有血凝性的報道［5］，冉智光等（1997）報道，TGEV通過超速離心或紅細胞與病毒－抗血清混合物在4℃孵育1h可產生26～28的凝集效價［6］，而本試驗發(fā)現(xiàn)，在不需要超速離心或4℃孵育的情況下，分離的TGEV NC株細胞毒通過3次凍融后3 000r／min離心3min后即能產生高達26的血凝價，這在國內屬首次報道。本試驗旨在分離豬傳染性胃腸炎病毒華南株，并對其進行深入研究，以期為華南地區(qū)豬傳染性胃腸炎的檢測和防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞、菌株及主要試劑 疑似TGE病豬肛拭子采自華南地區(qū)某豬場典型發(fā)病仔豬，低溫凍存后，送本實驗室經無菌處理保存?zhèn)溆茫籘GEV標準陽性血清抗體，購自瑞士SVANORIR公司；TGEV標準株（Purdue株）、大腸桿菌DH5α由華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院傳染病教研室保存；PK－15細胞由大華農生藥研發(fā)中心贈送；細胞培養(yǎng)液（DMEM）、新生牛血清（FBS）為美國 GIBCO／BRL公司產品；質粒抽提試劑盒和凝膠純化試劑盒為O－mega公司產品；病毒基因組RNA提取試劑盒，購自北京天根生物科技有限公司；ExTaqDNA聚合酶、核酸分子質量標準、pMD18－T Sample vector、M－MLV逆轉錄酶為TaKaRa公司產品。

1.2 病料處理 無菌采集疑似TGE感染發(fā)病仔豬肛拭子，于5mL滅菌生理鹽水中混勻，－20℃反復凍融3次，12 000r／min離心10min后取上清經0.22μm微孔過濾器過濾，置－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒分離 取－80℃保存的病料上清液，1 mL接種于單層PK－15細胞，37℃吸附1h，棄上清后加入含2%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4d，觀察細胞病變（CPE）。若4d后沒有CPE，則將培養(yǎng)細胞反復凍融3次，取凍融液1mL盲傳進行病毒分離和細胞適應，傳至出現(xiàn)較穩(wěn)定的CPE后收毒，盲傳6代未出現(xiàn)CPE則判為陰性。

1.4 病毒的雞紅細胞凝集特性試驗 參考冉智光（1997）略作改動，使用分離毒株在PK－15細胞上傳代3次后的毒液于－20℃反復凍融3次后離心取上清液按常規(guī)方法操作，同時以未接毒的正常PK－15細胞作對照。

1.5 病毒的血凝抑制試驗鑒定 分離毒株若有血凝特性，則血凝抑制試驗按常規(guī)方法操作，進行HI試驗時將標準抗體作2倍系列稀釋，配制4HA抗原固定不變，以正常PK－15細胞作對照，混合后37℃作用30min，加人0.5%紅細胞于37℃作用30 min后判定。

1.6 病毒TCID50的測定 取分離毒株第3代細胞毒液在EP管中作連續(xù)10倍稀釋，在96孔細胞培養(yǎng)微量板中每孔預先加入含8%小牛血清的培養(yǎng)液50μL，從10－1到10－10連續(xù)稀釋的病毒液每個稀釋度的毒液加一縱8孔，每孔加50μL，然后每孔加細胞懸液100μL（含細胞約4.0×105／mL），同時設細胞陰性對照，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，每天觀察記錄細胞病變（CPE），按Reed－Muench法計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染量（TCID50）。

1.7 病毒中和試驗 將TGEV陽性抗體進行系列稀釋（1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280），加到96孔反應板中，25μL／孔；將病毒稀釋到200TCID50，加入到上述各反應孔中，25μL／孔，37℃作用1h；按常規(guī)方法制成細胞懸液，50μL／孔加到上述各孔中，37℃培養(yǎng)，逐日觀察并記錄CPE。同時設立正常細胞對照、不加抗體的病毒液對照、陰性血清對照。

1.8 病毒的RT－PCR鑒定 試驗所用引物參照田小艷等（2009）報道，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。上游P1：5′－GATGGCGACCAGATAGAAGT－3′；下游 P2： 5′－GCAATAGGGTTGCTTGTACC－3′，擴增 N基因612bp的片段。然后按Trizol試劑盒說明的方法，直接從病料處理物中提取病毒基因組RNA，加入10μL進行反轉錄，RT－PCR反應參照試劑盒說明書進行，同時設立陰陽性對照。

1.9 病毒的基因序列分析 將RT－PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將目的條帶切膠純化DNA，將純化DNA與pMD－18TSample Vector于16℃過夜連接，隨后轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，挑取單個菌落并提取質粒進行電泳鑒定，每個克隆選取2個陽性樣品送北京奧科生物技術有限責任公司測序。

2 結果與分析

2.1 病毒分離 病料接種PK－15細胞后24h后即出現(xiàn)典型CPE，36h左右出現(xiàn)明顯CPE，CPE表現(xiàn)為細胞變圓，胞漿內形成空泡，融合縮小，細胞界限不清晰，有大片脫落區(qū)，沒有脫落的細胞出現(xiàn)拉網現(xiàn)象，細胞變細長，胞漿相連（圖1A）。當CPE達80%以上時，收毒并命名TGEV NC株，放－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 病毒的雞紅細胞凝集特性試驗 HA試驗按常規(guī)方法進行，NC株的血凝價為26（表1），同時對照組PK－15細胞液均無血凝現(xiàn)象。

圖1 TGEV NC株在PK－15細胞上的細胞病變（100×）

表1 TGEV NC株的HA試驗

2.3 病毒的血凝抑制試驗 按HA試驗結果，配制4HA抗原做HI試驗，結果顯示，TGEV抗體能抑制分離毒株的血凝作用，且HI滴度為28，同時對照組正常PK－15細胞液全部凝集。

2.4 病毒TCID50的測定 經過7d的觀察記錄，按Reed－Muench法計算出分離的NC株第3代在PK－15細胞中的 TCID50為10－7.15／0.1mL。

2.5 病毒中和試驗 利用固定病毒稀釋陽性抗體法進行試驗，能保護50%細胞的陽性抗體稀釋度介于1∶320～1∶640之間。根據(jù)Reed－Muench法計算標準陽性抗體的中和效價為1∶381，而分離毒株與陰性血清作用后全部出現(xiàn)CPE，陽性抗體對細胞毒性試驗以及空白試驗細胞正常。

2.6 RT－PCR鑒定 分別提取TGEV NC株PK－15細胞傳代3次后細胞液及陽性對照（Purdue株）的總RNA，參考說明書方法用M－MLV反轉錄為cDNA，摸索出特異性引物反應條件后，進行PCR擴增，以正常PK－15細胞液作對照，取5μLPCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。結果顯示，檢測引物可以從NC株在PK－15細胞傳3代的細胞液、陽性對照中擴增出約612bp的片段，而陰性對照組的正常PK－15細胞液沒有擴增出特異性條帶（圖2）。

圖2 TGEV NC株的RT－PCR檢測

2.7 TGEV NC株的N基因序列分析 選取國內報道較多的7株TGEV N蛋白基因與分離株的測序結果進行核苷酸同源性分析，結果如圖3。分離毒株（NC株）與P115 2007株、Purdue 2007株、SCY 2006株和WH－1 2010株核苷酸同源性最高，均達到99.8%。

3 討論

豬傳染性胃腸炎主要于冬春季節(jié)流行暴發(fā)，且在近些年多與豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬輪狀病毒（RV）等病原混合感染，造成了大量哺乳仔豬發(fā)病死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經濟損失，2010年以來TGE在我國一些地區(qū)出現(xiàn)了擴大流行的趨勢［7］。TGEV與PEDV、RV三種病毒臨床表現(xiàn)差異不大，很難通過臨床方法進行診斷，本試驗對TGEV的分離與鑒定給華南地區(qū)的TGE流行情況和診斷方法都提供了一定的參考依據(jù)。

TGEV可在多種細胞系如豬睪丸細胞（ST細胞）、豬腎細胞（PK－15細胞、IBRS－2細胞）、豬甲狀腺細胞等多種細胞上生長，本試驗采取典型腹瀉仔豬肛拭子，使用PK－15細胞分離培養(yǎng)，48h內出現(xiàn)了典型的CPE，再通過RT－PCR方法測序后確診為豬傳染性胃腸炎病毒，并命名為TGEV NC株，本試驗所用引物是針對TGEV的N基因3′端設計，而N基因所編碼的核衣殼蛋白是TGEV主要結構蛋白基因，可與基因組RNA組裝成核糖核蛋白復合物摻入病毒粒子，N蛋白不僅在病毒致病性、轉錄和翻譯及增強細胞免疫等方面起到重要作用，而且具有輔助增強病毒RNA復制的能力。比較分離株與其他毒株N基因序列，發(fā)現(xiàn)其高度保守，核苷酸同源性在97.2%～99.8%，表明此分離株N基因變異不大。

除了RT－PCR方法外，本試驗還使用了HA／HI、病毒中和試驗等方法進行鑒定，確定所分離的是TGEV毒株。關于TGEV的血凝性問題，學界內報道不盡相同，現(xiàn)已研究清楚的是IBV、HEV、BCV、HCV等冠狀病毒的血凝素都位于病毒的纖突蛋白上［8］，TGEV也屬于冠狀病毒，但不具有獨立的血凝素［9］，國內直到1997年才由冉智光等報道通過高速離心或4℃孵育后TGEV才會出現(xiàn)部分血凝性，而本試驗所分離的TGEV NC株通過－20℃反復凍融3次后低速離心純化即能有效凝集雞紅細胞，HA滴度為26，且此種血凝性能被TGEV抗體抑制，說明這種血凝性是該TGEV毒株特異的生物學特性，該研究為國內首次報道。

本試驗所分離到的NC毒株接種細胞后很快產生典型的 CPE，TCID50高達 108.15／mL，血凝價為26，這些特性與之前國內報道有顯著不同，該毒株是否發(fā)生了較大變異導致致病力增強及其與疫病暴發(fā)的關系等有待進一步的研究。冠狀病毒的血凝性與其S基因有密切的關系，我們將開展對NC株S基因及其他基因的變異研究。

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