運輸應激對大鼠空腸形態與熱休克蛋白家族mRNA表達的影響

舒班超，麻武仁，尹 朋，劉鳳華，侯曉林，鐘友剛，余 進，徐霄龍，萬長榮，宋曉平，許劍琴

（1.西北農林科技大學動物醫學院，陜西 楊凌712100；2.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀100193；3.北京農學院動物科技學院，北京 昌平102206）

運輸應激廣泛發生在動物的運輸過程中，運輸途中的各種刺激因子，對動物造成的心理和生理上的影響統稱為運輸應激。運輸應激對動物是一種強烈的刺激，動物經過運輸應激后易產生生長停滯、免疫抑制和組織損傷，嚴重時甚至導致動物死亡。由于運輸應激是多種應激原對機體的綜合作用，給運輸應激反應機理研究帶來較大困難。動物對于運輸途中的搖晃、高溫／低溫、震動、碰撞、噪音、饑渴、擁擠等刺激易產生應激反應［1］。本試驗利用搖床模擬了對運輸應激中較為重要的6個應激因子：搖晃、高溫、碰撞、噪音、饑渴、擁擠，并將搖晃與溫度刺激分別固定在60r／min與35℃，以使其得到重復性較好的大鼠運輸應激模型。運輸應激會造成動物重要器官如心臟、肝臟、腎臟等一定程度的損傷［2］，而關于小腸與運輸應激的關系尚未有人報道。小腸是機體消化吸收的重要器官，又被稱為應激反應的啟動器官，在應激反應中小腸黏膜最先遭受損傷，并導致腸道黏膜免疫屏障遭受破壞，腸道致病微生物的入侵會進一步加劇應激反應，并最終導致應激綜合征。

Hsps稱為熱休克蛋白家族，主要分為：Hsp90家族、Hsp70家族、Hsp60家族及小分子量Hsp27家族［3］，Hsp27是Hsp27亞家族中的重要一員，主要參與微絲的穩定和細胞因子信號轉導等，保護細胞免受各種應激因素的損傷［4］，Hsp70家族在幾乎所有生物的應激細胞中都經常高度地被誘導，廣泛參與各種保護機體和細胞的功能，在運輸應激部分器官中也會高度表達。Hsp90作為特異分子伴侶調節蛋白的生物活性，防止蛋白質的變性和聚集。它們對維護細胞生存和內環境的穩定有重要意義。然而動物運輸應激后Hsps在空腸中的表達情況，以及其與空腸損傷的關系尚罕見報道。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 成年雄性SD大鼠20只（北京維通利華實驗動物技術有限公司提供），體重為270±20g。

1.2 主要儀器和試劑 儀器 DHZ－CA型水平搖床（江蘇太倉儀器廠，中國）；Leica RM 2126RT型切片機（上海錸卡儀器有限公司，上海）；Olympus BX51生物顯微鏡（Olympus，日本）；BIO－RAD My－Cycler PCR 儀（BIO－RAD， 美 國）；Stratagene Mx3005P熒光定量PCR系統（Stratagene，美國）。試劑：蘇木精，依紅，Trizol Reagent（Invitrogen，USA）；M－MLV 反轉錄酶（Promeage USA）；RNA酶抑制劑（Promega，USA）；Brilliant II Fast SYBR Green QPCR Master Mix（Agilent Technologies，USA）。

1.3 運輸應激大鼠模型的建立 將20只270±20 g的SD大鼠適應性飼喂1周后，隨機均分為4組：對照組、運輸應激1d組、運輸應激2d組、運輸應激3d組。應激條件為35℃，60r／min，每天應激2h。應激后大鼠出現運輸應激臨床癥狀，以及血清皮質醇濃度升高，表明模型構建成功。

1.4 取材及材料處理 應激結束后，各組大鼠分別先進行體重與肛溫測定；眼球靜脈采血，分離血清進行皮質醇的測定；最后斷頭處死，暴露腹腔，分離腸道。將空腸組織分別放入4%中性甲醛溶液中固定或在液氮中冷凍保存。固定好的組織用于常規石蠟切片的制備，凍存的樣品則用于RNA提取與熒光定量PCR。

1.5 體重與肛溫測定 應激前后分別利用電子天平對大鼠進行體重測量，用電子溫度計插入肛門5cm處進行肛溫測量。

1.6 血液生化指標 血清中皮質醇（Cortisol）測定則采用放射免疫方法。

1.7 空腸病理組織學觀察 剖腹，取距Treitz韌帶下10cm的近端空腸3cm，進行組織病理學檢查。病理學檢查標本用4%甲醛溶液固定，常規脫水，石蠟包埋，組織塊包埋時力求方向垂直。標本經常規石蠟包埋后，做腸管橫切面的連續切片，切片厚度為5μm。切片后H.E.染色，鏡檢。

1.8 RNA提取與cDNA合成 取凍存空腸標本50mg，使用Trizol法提取總RNA。核酸蛋白儀檢測RNA濃度與純度，只有260／280比值介于1.9～2.1的RNA用于反轉錄。使用2μg總RNA進行反轉錄，反轉錄采用兩步法完成，cDNA產物－20℃保存。

1.9 熒光定量RT－PCR測定大鼠空腸中 Hsps mRNA的轉錄 根據GenBank上大鼠Hsp27、Hsp70和Hsp90的基因序列，利用Primer Premier 5.0引物設計軟件分別設計相應的引物，引物序列見表1。采用SYBR GREEN法對運輸應激前后大鼠空腸組織Hsps表達量進行熒光定量PCR分析。PCR反應體系如下：cDNA模板1μL、PCR Mix 10 μL、ROX 0.3μL，上下游引物各1μL，用滅菌蒸餾水加至20μL。擴增條件為95℃10min；95℃10 s，60℃30s，40個循環，每個循環結束時，收集熒光值；循環結束檢測融解曲線。大鼠Hsps mRNA的定量結果均用β－actin mRNA 的含量作歸一化 處理。

表1 Hsps引物序列

1.10 數據處理 試驗數據均以“平均數±標準誤”（X±SEM）表示，采用SPASS11.5統計軟件進行方差分析，對各組數據進行One－Way ANOVA比較，P＜0.05記為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 運輸應激對大鼠行為的影響 大鼠在運輸應激過程初期先表現為好動，適應后逐漸安靜。隨著應激時間延長，大鼠開始表現出焦慮，逃逸行為，并且開始吐沫，最后階段表現為精神委靡。若應激時間長于3h則大鼠發生死亡。

2.2 運輸應激對大鼠體溫與體重的影響 運輸應激1d和3d后，大鼠肛溫對比應激前顯著上升（圖1A）。表明運輸過程中大鼠代謝速率加快，導致機體產熱增加。運輸應激1d和3d后，大鼠體重顯著降低（圖1B）。說明，在運輸應激過程中，大鼠消耗了大量的體能，致使機體體重降低。2.3 運輸應激對大鼠血液皮質醇的影響 大鼠分別應激1d和3d后，相對于對照組血清中皮質醇濃度均顯著升高，應激2d后皮質醇濃度相對于對照組升高但不顯著（圖2），說明大鼠已處于應激狀態。大鼠運輸過程中的行為變化，體溫升高、體重降低，以及皮質醇濃度的升高，表明運輸應激模型構建成功。

2.4 運輸應激對大鼠空腸形態H.E.染色觀察H.E.染色后光鏡下觀察可見，對照組大鼠空腸腸結構完整，層次分明，腸黏膜上皮細胞的輪廓清晰，排列規則。柱狀上皮細胞，呈高柱狀單層排列，胞漿豐富，胞核橢圓形，位于細胞基部。杯狀細胞散在于柱狀上皮細胞之間，呈高腳杯狀（圖3A）。而運輸應激后1，2，3d，大鼠空腸黏膜均受不同程度損傷，絨毛頂部上皮細胞部分脫落現象（圖3），從小腸的前段到后段，損傷程度逐漸減輕。第1天運輸應激大鼠空腸結構變化，主要表現為絨毛頂端上皮細胞部分脫落（圖3B），應激第2天則表現為絨毛頂端上皮細胞成片剝離（圖3C），而應激第3天絨毛大面積剝離，且絨毛長度變短（圖3D）。杯狀細胞的數量也隨著應激時間的增加而增加。

圖3 分別運輸應激1，2，3d后大鼠空腸H.E.染色圖片（200×）

2.5 空腸Hsps mRNA表達量變化 我們選取了具有代表性的運輸應激1d和3d的大鼠，分別代表單次應激和多次應激進行基因表達水平研究。對于應激2d的大鼠沒有繼續進行試驗。由圖4可見，分別經2h運輸應激1d和3d后，Hsp27、Hsp70、Hsp90mRNA表達量與對照組相比均顯著升高。其中Hsp27在應激第1天升高8.6倍，在第3天則升高了10.5倍（圖4A）。Hsp70升高最為顯著，在第1天應激結束后表達量上升了45.5倍，而第3天應激結束時繼續升高至54倍（圖4B）。Hsp90第1天升高了3.6倍，應激3d升高了3.3倍（圖4C）。

3 討論

運輸應激是動物對運輸途中多種應激原刺激所做出的反應。實際運輸過程中由于應激原條件變化較大，給科學評價機體對運輸應激反應帶來較大困難。因此選取合適的儀器進行模擬，并對應激條件進行固定，有一致［1，5］，表明利用搖床在60r／min，35℃，2h的條件下可以很好的模擬公路運輸應激。

先前研究表明，運輸應激可以引起心臟、肝臟、腎臟發生損傷，本試驗中我們發現運輸應激也會引起空腸的明顯損傷。伴隨著應激時間的增加，大鼠空腸結構發生病理變化，損傷逐漸加重。空腸絨毛從頂端上皮細胞部分脫落，變為絨毛上皮細胞成片剝離，最后呈現為絨毛上皮細胞大面積剝離，且絨毛長度變短。應激時機體內熱休克蛋白的表達量會發生急劇變化，以保護組織細胞免受傷害。細胞內Hsp尤其是Hsp27和Hsp70可抑制應激激活蛋白激酶，抵制細胞凋亡信號轉導中的蛋白水解酶和氧自由基生成，并抑制p53介導的細胞凋亡，從而可在熱應激、氧化應激、電離射線等引起的細胞凋亡中起保護作用［6］。據李玉保等人報道，豬經1、2、4、6h和10h的運輸應激后，在豬腎臟［7］、肝臟和心臟［8］組織中Hsp70mRNA的轉錄水平隨著應激時間的延長一直呈現上升的趨勢［9］。同樣在Hsp90的研究上，李玉保、鮑恩東等人報道，Hsp90mRNA表達量在肝臟和心臟［8］中上升。在我們的試驗中，我們得到了相似的結果，大鼠空腸中 Hsp27，Hsp70，Hsp90mRNA的表達量在運輸應激后均顯著上升。相比應激第1天，應激第3天Hsp27與Hsp70mRNA表達量持續升高，而Hsp90mRNA的表達量則在第3天較第1天有所下降。

本試驗中隨著大鼠運輸應激時間增加，空腸病理變化逐漸加重，同時Hsp27，Hsp70，Hsp90的表達量也大幅升高。表明大鼠空腸組織損傷與Hsps表達量之間有著直接的聯系。運輸應激中Hsp27，Hsp70可能參與了對抗運輸應激所引起的損傷與凋亡。Hsp90則可能主要在運輸應激中參與修復應激中損傷的蛋白分子。作為一類保護性分子，Hsps在大鼠運輸應激后空腸組織內表達量急劇升高，可以起到保護空腸組織細胞，抵抗應激性損傷的作用。運輸應激后表達量急劇升高的Hsps，可能是動物抵抗運輸應激的重要機制之一。

［1］Fazio E，Medica P，Aronica V，etal.Circulating beta－endorphin，adrenocorticotrophic hormone and cortisol levels of stallions before and after short road transport：stress effect of different distances［J］.Acta Veterinaria Scandinavica，2008，50（1）：6.

［2］Zhu L，Bao E，Zhao R，etal.Expression of heat shock protein 60in the tissues of transported piglets［J］.Cell Stress and Chaperones，2009，14（1）：61－69.

［3］Kregel K C：Invited Review：Heat shock proteins：modifying factors in physiological stress responses and acquired thermotolerance［J］.Journal of Applied Physiology，2002，92（5）：2177－2186.

［4］Mehlen P，Schulze－Osthoff K，Arrigo A－P：Small Stress Proteins as Novel Regulators of Apoptosis［J］.Journal of Biological Chemistry，1996，271（28）：16510－16514.

［5］Tadich N，Gallo C，Brito M L，etal.Effects of weaning and 48htransport by road and ferry on some blood indicators of welfare in lambs［J］.Livestock Science，2009，121（1）：132－136.

［6］Samali A，Cotter T G：Heat Shock Proteins Increase Resistance to Apoptosis［J］.Experimental Cell Research，1996，223（1）：163－170.

［7］李玉保，鮑恩東，趙茹茜.長途運輸應激對豬腎臟中 Hsps mRNA轉錄水平及定位影響［J］.江西農業大學學報，2007，29（6）：857－861.

［8］李玉保，鮑恩東，王志亮，等.熒光定量RT－PCR法檢測運輸應激豬熱休克蛋白mRNA轉錄水平［J］.中國農業科學，2006，39（1）：187－192.

［9］Yu H，Bao E－d，Zhao R－q，etal.Effect of transportation stress on heat shock protein 70concentration and mRNA expression in heart and kidney tissues and serum enzyme activities and hormone concentrations of pigs［J］.Anglais，2007，68（11）：1145－1150.