玉米秸稈水解液發酵產微生物油脂動力學研究

馮 沖 李領川 趙國欣 董彩霞 李建新 華慧穎

玉米秸稈水解液發酵產微生物油脂動力學研究

馮 沖1李領川1趙國欣1董彩霞2李建新2華慧穎2

(中州大學實驗管理中心1，鄭州 450044)
(中州大學化工食品學院2，鄭州 450044)

對發酵性絲孢酵母在玉米秸稈水解液中發酵合成微生物油脂動力學特性進行了研究。采用Logistic菌體生長模型、Luedeking－Piret模型和產物生成的基質消耗模型，描述了完整發酵過程的動力學特性，提出了發酵過程中菌體生長、微生物油脂合成、基質消耗的動力學模型。采用牛頓迭代法對模型參數進行非線性擬合，結果表明，模型計算與試驗數據能較好地擬合，菌體生長、產物油脂生成及糖分消耗等3條曲線的相關指數R2分別為0．990、0．987和0．890。表明該動力學模型可以較好描述發酵性絲孢酵母發酵過程的動力學特征。

玉米秸稈 發酵 生物油脂 動力學模型 參數估計

秸稈是地球上豐富的可再生資源。據聯合國糧農組織統計，世界秸稈年產量為20～30億t，中國每年農作物秸稈產量約7億t，占全世界秸稈總量的20%～30%［1］，其中玉米秸稈、小麥秸稈和稻稈占75%以上。一些產油微生物能夠有效利用各種農林廢棄物及工業和農副產品下腳料，直接轉化為微生物油脂，再進一步轉化為生物柴油，這樣不但可以使廢棄物得到合理的利用，同時又開辟了一條清潔能源再生途徑。目前利用玉米秸稈發酵生產生物油脂已有報道，莫夏迪等［2］發現粘紅酵母有較強的生長適應能力，能在不添加其他任何營養物質的高粱秸稈汁里很好的生長，并且能達到生物量16．73 g/L，油脂含量22．73%。潘麗霞等［3］利用蔗渣半纖維素水解物發酵產油，油脂得率系數分別為13．49和10．23，顯示了利用蔗渣這種廉價原料生產微生物油脂的潛力。馮沖等［4］對玉米秸稈稀酸水解液的脫毒后發酵產脂條件進行了優化，菌體生物量達21．2 g/L，油脂含量為50．9%。沈珺珺等［5］研究了產油酵母菌皮狀絲孢酵母(Trichosporon cutaneum)利用經過簡單脫毒處理的大米草水解液，直接發酵生產微生物油脂，產油量最高達6．0 g/L。里偉等［6］以一株高產油脂圓紅冬孢酵母菌(Rhodosporidum toruloides Y4#)干菌粉為原料，分別研究了無溶劑體系中三步甲醇法及在叔丁醇介質體系中脂肪酶催化合成微生物柴油，其得率可達90%左右。但玉米秸稈發酵產微生物油脂的動力學特性研究還未見報道。發酵動力學是用數學模型定量描述發酵過程中菌體生長、基質消耗、產物生成的動態平衡及其內在規律［7］，是工業放大過程中設計、操作和模擬優化的基礎。建立動力學模型并對發酵過程的數據進行分析有助解決工業化生產中將會遇到的許多問題。本試驗采用實驗室自行篩選的高產油脂菌株IFFI01368，對玉米秸稈水解液發酵產生物油脂動力學特性進行了研究。

1 材料與方法

1．1 材料

發酵性絲孢酵母(Trichosporon fermentans)IFFI01368購自中國食品發酵工業研究院。

玉米秸稈(鄭州郊區)切割粉碎30～40目。

商品木聚糖酶及纖維素酶產品購于上海杰能科酶制劑公司，其中木聚糖酶酶活1．76×106u/mL，纖維素酶酶活2．07×106u/mL。

發酵產脂培養基配制方法見文獻［8］。

1．2 試驗方法

1．2．1 玉米秸稈水解液的制備

每300 mL的三角瓶中稱取10 g玉米秸稈粉，在濃度為1%的稀硫酸，121℃條件下預處理60 min后，加入蒸餾水并調整到pH 5．0，液固比為10∶1，MgCl2為2．5 nmol/L，吐溫80為1．5 mL/L，加入纖維素酶2．5 g/100 g和木聚糖酶液2 mL/100 g，在50℃的條件下糖化48 h，經普通濾紙過濾得水解糖化液。測得玉米秸稈的總還原糖濃度為(5．0±0．3)%，經測定葡萄糖和木糖占總還原糖的(87±2)%［9－10］。在水解糖化液中，補加4%的蔗糖，pH 5．5，300 mL三角瓶盛裝玉米秸稈水解液50 mL，分裝，包扎，滅菌［8］。

1．2．2 種子液的制備

從活化的IFFI01368斜面挑取適量菌種，接入盛裝50 mL種子液培養基的300 mL三角瓶中，進行震蕩培養22 h，溫度27℃，轉速150 r/min。

1．2．3 發酵產脂培養

分裝后的玉米秸稈水解液121℃滅菌20 min，然后將種子液按10%的接種量轉接于秸稈水解液中進行產脂發酵培養，條件為150 r/min，27℃，4 d。發酵過程中，每6 h取出3個三角瓶，測定菌體生物量，油脂含量及總糖含量。

1．2．4 分析測定方法

總糖含量測定:3，5一二硝基水楊酸(DNS)法［11］。

木糖含量測定:地衣酚法［12］。

菌體生物量的測定:通過4 500 r/min離心10 min，收集菌體并干燥(干燥溫度80℃)至衡重，準確稱取干菌體量。

生物量(DW)=干菌體/發酵液

油脂抽提:精確稱取一定量粉碎后的干菌體，每克干菌體添加40 mL鹽酸水解法，室溫下靜置20 min，沸水浴加熱10 min，加入適量氯仿 － 甲醇(2∶1，體積比)，振蕩30 min，然后在4 500 r/min下離心15～20 min，分液，取氯仿層，真空干燥除去氯仿即得油脂，計算油脂得率［13］。

油脂含量=粗油脂質量/菌體干重×100%油脂濃度=粗油脂質量/發酵液體積

1．3 模型建立

1．3．1 菌體生長動力學模型

菌體生長動力學最常用方程有Monod方程和Logistic方程。由于Monod方程是理想化模型有一定的局限性，而Logistic方程是一個典型的S型曲線，能很好地反映發酵過程中普遍存在的菌體濃度增加對自身生長的抑制作用［14］。所以采用Logistic方程構建菌體生長動力學模型較為合適，Logistic方程為:

式中:k最大比生長速率;Co初始菌體質量濃度/g/L，本試驗中Co=5．3 g/L;初始條件t=0時，菌絲體濃度Cx等于接種后的菌絲體Co;Cx菌體質量濃度/g/L;CM最大菌體質量濃度/g/L。

1．3．2 油脂生成動力學模型

由酵母油脂發酵試驗結果及相關文獻［15］可知，油脂的合成與菌體生長為偶聯型，可以用Luedekingpirets方程來描述這一規律。即有:

式中:m1，m2為模型參數，Cx為菌體質量濃度/g/L;P0為初始油脂含量，初始條件t=0時P0=0;P為油脂質量分數/%。

1．3．3 底物消耗模型

菌體發酵過程中，底物的消耗一方面用于菌體的生長，另一方面則用于產物的合成及其代謝，因此，底物消耗速度可由下式表示:

式中:Cx為底物糖濃度/g/L;Yx/s為對底物菌體的得率系數，g(菌體干重)/g(糖分);ke為細胞維持常數，g糖分/g(菌體干重)/h;Yp/s對底物產物的得率系數，g(產物)/g(糖分)。系數將為正值。S0為初始糖濃度，初始條件t=0時，S=S0=86．0 g/L;S(t)為時間t時的底物糖質量濃度/g/L。

1．4 數據處理

使用Excel 2000中的規劃求解對積分方程進行分析處理計算，通過牛頓運算法則，經過100次迭代，使試驗值和方程式預測值之間的誤差平方和SSE趨于最小。

2 結果與分析

2．1 產脂發酵過程

圖1 發酵過程菌體生物量、底物總糖濃度和產物油脂含量的變化

圖1 為玉米秸稈水解液發酵過程中菌體生長、底物還原糖濃度和產物油脂含量隨時間變化的代謝曲線。由圖1可以看出，發酵前30 h，菌株處于生長延遲期，耗糖速率較低，菌體生物量，油脂含量緩慢增加。30 h之后，菌體進入對數生長期，生長速度逐漸加快，同時產物油脂生成速率加快，對應著底物糖分的消耗。到78 h左右，進入菌體生長穩定期，底物糖分基本耗盡，產物油脂變化很小，說明發酵周期可以控制在78 h之內。在發酵后期，由于基質糖分基本耗盡及發酵液中有毒物質的作用，菌體死亡率上升，同時油脂含量降低，說明菌體可能在糖分耗盡后又開始以自身油脂作為碳源和能源。

2．2 發酵動力學模型

2．2．1 菌體生長動力學模型

對方程(1)積分可得生物量(Cx)與時間(t)函數:

將模型參數代入方程(2)中，求得發酵過程中菌體生長動力學模型如下:

圖2 發酵過程菌體生物量模型計算值與試驗值比較

圖2 中菌體生物量試驗值和模型擬合值的相關系數R2=0．990，說明此模型能夠很好地描述菌體在發酵過程中的生長情況。

2．2．2 油脂生成動力學模型

將方程(1)代入方程(4)得:

將方程(2)代入方程(4)得積分方程(6):

將模型參數代入方程(6)中，求得發酵過程中產物的生成動力學模型(7):

圖3 發酵過程產物油脂含量模型計算值與試驗值比較

圖3 中菌體產脂試驗值和模型擬合值的相關系數R2=0．987，說明此模型能夠很好地描述菌體在發酵過程中的油脂積累情況。

2．2．3 底物消耗模型

將方程(1)、方程(4)代入方程(8)可得:

將b1，b2代入積分得:

圖4 發酵過程底物還原糖濃度模型計算值與試驗值比較

圖4 中菌體還原糖質量濃度試驗值和模型擬合值的相關系數R2=0．890，說明此模型能夠較好地描述菌體在發酵過程中的生長及產脂情況。

2．3 參數估計

綜合以上3部分動力學分析結果，經過擬合的動力學參數如表1所示。

表1 發酵動力學模型參數

參數估值擬合結果如表1和圖2～圖4所示，采用相關指數R2來考察擬合效果，得到菌體生長、油脂生成、糖分消耗等3條曲線的相關指數R2分別為0．990、0．987和0．890。由此可以看出，前兩者擬合效果很好，而糖分消耗擬合效果稍差，可能是由于在稀酸水解過程中會生成對酵母細胞的生長和代謝有抑制作用的毒性物質，例如甲酸、乙酸、糠醛、羥甲基糠醛、糖醛酸、己糖酸等，影響了細胞對糖分的吸收。

3 結論

根據菌株IFFI01368發酵試驗數據，建立了玉米秸稈水解液發酵產脂過程的動力學模型，描述了菌體生長、產物油脂形成和底物糖分消耗變化的整個過程，采用牛頓迭代法對模型參數進行了非線性擬合。結果表明，菌體生長、油脂生成、糖分消耗等3條曲線的相關指數R2分別為0．990、0．987和0．890。由表1和圖1～圖4可以看出，其擬合良好，所建立的模型較好地反映了玉米秸稈水解液發酵代謝過程基本特征及其動力學機制，可用于進一步設計大型發酵工藝。

［1］陳合，張強．菌酶共降解玉米秸稈的工藝研究［J］．農業工程學報，2008，24(3):270－272

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［5］沈珺珺，李富超，楊慶利，等．皮狀絲孢酵母利用大米草水解液發酵生產微生物油脂［J］．海洋科學，2007，31(8):38－41

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［7］李艷．發酵工業概論［M］．北京:中國輕工業出版社，1999

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［12］馮沖．高純度生物柴油原料的微生物轉化技術研究［D］．河南:河南農業大學，2007

［13］曹健，汪晨輝，曾實，等．卷枝毛霉Mucorcircinelloides3．2208油脂幾種提取方法的比較［J］．中國油脂，2004，27(4):38－40

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Dynamics Study on Microbial Oils Production by Corn Straw Hydrolysate Fermentation

Feng Chong1Li Lingchuan1Zhao Guoxin1Dong Caixia2Li Jianxin2Hua Huiying2
(Experimental Management Centre，Zhongzhou University1，Zhengzhou 450044)
(College of Chemical Engineering and Food Science，Zhongzhou University2，Zhengzhou 450044)

We performed research on dynamics speciality that using fermentation of the trichosporon fermentans into corn straw hydrolysate to synthetize microbial oils．The dynamics speciality of complete fermentation process was described based on Logitstic thallus growth model，Leudeking－Piret model and matrix consumption model that the product generated and dynamics models of thallus growth during fermentation，microbial oils synthesis and matrix consumption was also described．The parameters in the models were nonlinear fitting through Newton iterative method．The results showed that the predicted value by the dynamics models could fit well with the experimental data，and the relative index R2of the thallus growth，product lipid generating and sugar consumption were 0．990，0．987 and 0．890 respectively．The results also indicated that the dynamics models could better describe dynamics features of the process of trichosporon fermentans．

corn straw，fermentation，lipid，dynamics model，parameter estimation

Q936;S37

A

1003－0174(2012)10－0013－05

河南省教育廳2011自然科學基金(2011C1 80001)，鄭州市科技局2010年自然科學基金(10PTGG345－3)

2012－02－09

馮沖，女，1970年出生，講師，生物能源工程

華慧穎，女，1972年出生，副教授，生物能源和動物遺傳