金屬鹽離子對苦蕎萌發及其總黃酮含量的影響

李曉丹 王 莉 王 韌 陳正行

金屬鹽離子對苦蕎萌發及其總黃酮含量的影響

李曉丹 王 莉 王 韌 陳正行

(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室江南大學，無錫 214122)

研究了在一定濃度的鋁、鋅、銅鹽溶液浸種后，苦蕎種子萌發7 d內發芽勢、發芽率、粗蛋白含量的變化，并采用正交試驗法設計，用吸光光度法測定樣品中的總黃酮含量。結果表明，鋁、鋅、銅鹽溶液浸種萌發對種子的芽苗生長和粗蛋白含量增加有促進的作用，而對發芽勢和發芽率影響并不顯著;正交試驗發現對總黃酮含量影響因素顯著性依次為萌發溫度＞萌發時間＞金屬鹽種類，最佳萌發工藝條件為:金屬鹽種類為1 000 mg/L硫酸鋁溶液，萌發時間為84 h，萌發溫度25℃，在此工藝條件下，苦蕎種子中總黃酮含量可以達到1 347．1 mg/100 g DW。

苦蕎 萌發 粗蛋白 總黃酮含量

蕎麥隸屬蓼科(Polygonaceae)，蕎麥屬(Fagopyrum Mill．)，為非禾本科谷物，主要的栽培品種有2種，即甜蕎麥(F．Esculentum Moench，普通蕎麥)和苦蕎麥［F．Tataricum(L．)Gaertn，韃靼蕎麥］［1］。

苦蕎是一種營養價值很高的雜糧，其中蛋白質、脂肪含量遠遠高于大米、小麥;另外，在保健功能方面，苦蕎中富含多種微生物、礦物質和膳食纖維，特別是含有豐富的生物類黃酮物質［2］。苦蕎中的黃酮主要成分為蘆丁(槲皮素－3－O－蕓香糖苷)、槲皮素、山奈酚和桑色索等黃酮醇［3］。蘆丁(Rutin)是苦蕎含量最高的黃酮，質量分數高達1．08%～6．6%，是甜蕎麥的9～300倍，占總黃酮質量分數的70%～85%，在降血壓、降血糖、抗腫瘤和提高免疫力等方面具有相當重要的作用［4－5］。我國苦蕎麥遺傳多樣性極為豐富，主要分為黃苦蕎和黑苦蕎，黃苦蕎即普通苦蕎，而黑苦蕎外殼呈黑色，種植面積小，蘆丁含量是黃苦蕎的3～5倍，其營養價值要比黃苦蕎高得多［6］。

谷物、豆類等經適當的發芽處理后，其化學成分均有所改變，營養價值得以提高并且形成獨特的風味及口感。近年來研究發現苦蕎及其芽苗中富含抗氧化的黃酮類物質和手性肌醇單體，將其作為一種新型的食物原料和蔬菜備受消費者青睞。種子在浸泡過程中使用適量濃度的鹽液浸種，使植物機體產生抗逆性反應，在萌發中產生更多功能性物質［7－8］。近年來有研究表明，蕎麥種子萌發后可使其蛋白質的組成有所改變［9－10］，消化率顯著改善［11－12］;在鋁浸種后，種子在萌發的過程中通過提高細胞內的POD和CAT活性、增加蛋白質和可溶性糖含量、提高黃酮類化合物的含量及其活性來提高蕎麥的鋁適應性［13－14］;通過在營養液中添加一些種子生長的必須微量元素，可使得芽苗產量顯著增加，而這些芽苗中富集的微量元素亦對人體有益［15－16］。

因此，本試驗研究了在一定萌發時間和溫度下，用不同的金屬鹽溶液浸種后，黑苦蕎種子的發芽率和芽長以及萌發的黑苦蕎中粗蛋白和總黃酮含量的變化，以期為獲得富含黃酮類物質的苦蕎種子及芽苗提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 材料與設備

黑豐1號:內蒙;次氯酸鈉(CP)、硫酸鋁、硫酸銅、硫酸鋅、六水氯化鋁、乙酸鉀、乙醇、甲醇、濃硫酸、氫氧化鈉:均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司;溴甲酚綠－亞甲基紅指示劑(3∶2)、蕓香苷:國藥集團化學試劑有限公司。

UV－1800型紫外可見分光光度計:上海美譜達(MAPADA)儀器有限公司;LRH－150生化培養箱:上海恒科學儀器有限公司。

1．2 試驗方法

1．2．1 苦蕎種子萌發試驗

苦蕎種子經除雜后，用5%次氯酸鈉浸泡30 min［17］，用去離子水沖洗干凈。用一定濃度的鹽液浸泡6 h［18］，浸泡溫度與后萌發溫度一致。雙層去離子水濕潤紗布鋪于萌發容器內，將苦蕎種子均勻的攤開，蓋單層去離子水濕潤紗布，在恒溫培養箱中培養。定時收取萌發的苦蕎種子50℃烘箱干燥，磨粉，過60目篩，供測定用。

苦蕎種子的萌發容器是用細棉線交叉綁在搪瓷托盤上，將濕潤的紗布鋪在細棉線上，搪瓷托盤底部盛去離子水，紗布被棉線架空不與搪瓷托盤底部的去離子水接觸，其中所用萌發器具和萌發空間均用75%的乙醇溶液消毒。

1．2．2 苦蕎種子萌發狀況的測定

測定發芽勢、發芽率以及7 d內萌發種子的芽長是根據GB/T 3543．4—1995農作物種子檢驗規程發芽試驗中所述的方法。

發芽勢=4 d發芽的種子數/供試種子數×100%

發芽率=7 d發芽的種子數/供試種子數×100%

測定不同鹽溶液浸種后萌發7 d內苦蕎種子中粗蛋白含量是根據GB 5009．5—2010食品中蛋白質的測定中所述的凱氏定氮法并稍加改動。

1．2．3 試驗設計

1．2．3．1 單因素試驗

萌發中浸種鹽液的種類及其濃度:本試驗選用3種無機鹽作為萌發時浸種的溶液進行試驗對比，分別為硫酸鋁溶液(濃度梯度為100、500、1 000、2 000、4 000 mg/L)、硫酸鋅溶液(濃度梯度為100、300、500、700、900 mg/L)和硫酸銅溶液(濃度梯度為20、40、60、100、200 mg/L)。試驗條件為萌發溫度25℃，萌發時間72 h。

萌發溫度:分別以15、20、25、30、35℃為萌發溫度進行試驗對比。浸種液均為水，萌發時間為72 h。

萌發時間:分別以48、60、72、84、96 h為萌發溫度進行試驗對比。浸種液均為水，萌發時間為25℃。

1．2．3．2 正交試驗

在單因素試驗基礎上，確定上述3因素的上下臨界限，按照L9(34)正交表進行正交試驗。

1．2．3．3 萌發苦蕎中總黃酮類物質的提取與測定

總黃酮類物質的測定方法是采用NY/T 1295—2007蕎麥及其制品中總黃酮含量的測定中所述方法并稍加改動［19］。

提供取粉碎后樣品0．2 g，精確至0．000 1 g，置于150 mL具塞三角瓶中，加入70%甲醇溶液30 mL，將三角瓶置于(65±2)℃的恒溫水浴震蕩器中在(130±10)r/min的振蕩頻率下振搖6 h，趁熱用離心機于3 000 r/min離心，上清液置于50 mL容量瓶中，冷卻至室溫，用70%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，為試樣待測液。

采用分光光度法，以標準蘆丁為參照物進行測定。

標準曲線的繪制:用移液管分別吸取蘆丁標準溶液0．25、0．50、1．0、2．0、3．0、4．0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入三氯化鋁溶液2 mL、乙酸鉀溶液3 mL，用甲醇溶液定容至刻度，搖勻，室溫下放置30 min。同時做空白。標準曲線中蘆丁含量分別為0．001 25、0．002 50、0．005 00、0．010 0、0．015 0、0．020 0 mg/mL。在波長420 nm處測定吸光度。以吸光度值為橫坐標，濃度值為縱坐標，繪制標準曲線。

樣品中總黃酮含量的測定:準確吸取1．0 mL試料待測液置于10 mL容量瓶，其他操作與標準曲線的繪制相同。

1．2．3．4 萌發苦蕎中金屬鹽離子殘留的測定

鋁離子殘留量的測定采用GB/T 5009．182—2003面制食品中鋁的測定中所述方法［20］并稍加改動。銅離子和鋅離子殘留量的測定方法是采用GB/T 14609—2008糧油檢驗谷物及其制品中銅、鐵、錳、鋅、鈣、鎂的測定火焰原子吸收光譜法［21］。

1．2．4 統計方法

相關數據用SPSS軟件處理，P＜0．05為差異顯著，P＜0．01為差異極顯著。

2 結果與分析

2．1 不同浸種液及萌發時間對苦蕎種子生長狀況的影響

種子浸種后，按照1．2．1和1．2．2中所述方法在25℃下對苦蕎種子進行7 d萌發并測定其發芽勢、發芽率和芽長，結果見表1，圖1。萌發狀況的測定中Al3+、Zn2+和Cu2+質量濃度分別為1 000、500和60 mg/L，對照組浸種液為水。

表1 不同溶液浸種萌發后苦蕎種子的發芽勢和發芽率

苦蕎種子在萌發12 h后均吸水膨脹，偶有露白，12～24 h中大部分種子有出芽現象，芽長約0．2 cm。從表1中可以看出，與水浸種萌發相比，金屬鹽浸泡萌發對苦蕎種子的發芽勢和發芽率并無顯著影響，3種鹽溶液在發芽勢和發芽率也沒有明顯的區別。

但由圖1中可知，較水浸種萌發，經鹽溶液浸種后的種子芽長更長，同樣時間內生長速度更快，得到的芽體更多。另外，3種鹽溶液中鋁鹽浸種后的芽體生長情況最好，萌發7 d時芽體長達7．34 cm，比水浸種萌發7 d時增加了22．07%，有利于增加產量，而鋅與銅鹽浸種后效果區別不大，但都優于水浸中的效果。綜上所述，經鹽溶液浸種的苦蕎種子芽體生長比水浸種后種子生長速度快，同時間內芽體更長。

圖1 不同溶液浸種萌發后苦蕎種子的芽長

2．2 不同浸種液及萌發時間對苦蕎種子中粗蛋白及黃酮含量的影響

2．2．1 浸種液及萌發時間對粗蛋白含量的影響

經測定，本試驗所用原料中所含粗蛋白含量為17．76 g/100 g DW。苦蕎種子經水浸種后，萌發0～1 d時，蛋白質含量略有下降，1～4 d時蛋白質含量隨萌發時間的延長而增加，于第4天時達最大值19．52 g/100 g DW，之后5～7 d隨萌發時間延長，蛋白質含量下降，至第7天含量下降至15．85 g/100 g DW。而經鋁、銅、鋅溶液浸種后的苦蕎種子，萌發0～2 d時，蛋白質含量持續下降，隨后2～7 d，經鋁和銅溶液浸種后的種子蛋白質含量隨時間延長而增加，至第7天含量達最大值，分別為21．87、22．95 g/100 g DW，而經鋅溶液浸種后的種子蛋白質含量在2～6 d中持續增加，至第6天達最大值21．20 g/100 g DW，之后含量急劇下降。綜上所述，鹽溶液浸種對萌發的苦蕎種子萌發后期蛋白質分解用于芽體自身生長起到了一定抑制的作用，并在萌發過程中有利于蛋白質含量的增加。但增加的蛋白質是否易于消化吸收則有待于做進一步的探討。

圖2 苦蕎種子經不同鹽溶液浸種后萌發7d內粗蛋白含量

2．2．2 浸種鹽液的種類及其濃度對苦蕎種子中總黃酮含量的影響

未萌發的苦蕎種子中總黃酮含量為572．3 mg/100 g DW。

不同浸種鹽液及其濃度對苦蕎中總黃酮含量的影響見圖3，萌發溫度和時間均為25℃、84 h。

圖3 不同質量濃度的3種鹽溶液浸種后對總黃酮含量的影響

由圖3可以發現，用硫酸鋁溶液浸種時，當溶液質量濃度為1 000 mg/L，樣品中總黃酮含量最高，比未萌發樣品中總黃酮含量增加125．15%，比用水浸種萌發后所得樣品含量增加21．92%，隨著硫酸鋁溶液濃度增大，其總黃酮含量減小，并趨于平緩;用硫酸鋅溶液浸種時，當溶液質量濃度為500 mg/L，樣品中總黃酮含量達最大值，比未萌發樣品含量增加116．84%，與水浸種相比增加17．46%;用硫酸銅溶液浸種時，當溶液質量濃度增至60 mg/L時，樣品中總黃酮含量最高，比未萌發樣品含量增加118．35%，比水浸種增加24．53%，之后含量隨濃度增加而下降并趨于穩定。

綜上所述，用所選3種鹽溶液浸種后的萌發苦蕎中所含總黃酮含量與未萌發種子相比均大幅度增加。每種溶液最佳濃度有所不同，Al、Zn、Cu 3種鹽液浸種的最佳質量濃度分別為1 000、500、60 mg/L。3種鹽液低濃度浸種時，萌發種子中總黃酮含量均比水浸種含量略低，但隨著濃度適量增加，總黃酮含量大幅度增加，浸種鹽液濃度繼續增加，總黃酮含量反而呈現出了下降的趨勢，并趨于平緩。另外，此處所選3種浸種鹽對于促進種子總黃酮含量增加的原理并不相同，Al鹽是對種子產生毒害機制，使種子對其產生抗逆性而增加植物中對人類有益成分的含量;而Zn是種子生長所必需一種元素，用Zn鹽浸種可使種子生長速度加快;Cu既是種子生長的必需元素，在一定濃度下也會對種子產生毒害機制，從兩個方面對種子進行脅迫。

2．2．3 萌發時間與萌發溫度對苦蕎種子中總黃酮含量的影響

由圖4a可以發現，隨著萌發時間的增加，苦蕎種子中的總黃酮含量呈增長趨勢，48～60 h階段增長速度較為緩慢，至72 h時含量比60 h時大幅度增加，與水浸中相比增加到72～96 h階段含量雖有增加，但速度緩慢，萌發96 h時總黃酮含量僅比72 h增加5．53%。但是，過長的萌發時間會提高種子霉變的幾率，影響芽體的生長，污染其他種子，使種子的萌發過程不易控制，因此種子的萌發時間不宜超過96 h。

圖4 萌發時間與萌發時間對總黃酮含量的影響

由圖4b中可見，當溫度為25℃是，種子中總黃酮含量最高;當溫度為30℃時，種子中總黃酮含量呈現出明顯降低的趨勢。苦蕎為耐寒植物，較高的溫度不適合苦蕎種子的生長。

2．3 萌發苦蕎的工藝優化試驗

通過對苦蕎種子中總黃酮含量的單因素分析，得出如下工藝參數范圍:浸種鹽液為1 000 mg/L的硫酸鋁溶液、500 mg/L的硫酸鋅溶液和60 mg/L的硫酸銅溶液;萌發時間為60～84 h;萌發溫度為20～30℃。為了得到最佳的提取效果，以苦蕎種子中總黃酮含量作為指標，對上述因素進行正交優化試驗，結果見表1。

表1 因素水平表

由表2可以發現，影響因素的顯著性大小關系為:萌發溫度＞萌發時間＞浸種鹽種類。

表2 優化試驗以及直觀差分析表

由表3可知，3個因素均對苦蕎種子中的總黃酮含量有顯著性影響，其中萌發溫度對其有非常顯著的影響。由此可確定使用鹽浸種萌發苦蕎種子的最佳條件為:浸種鹽為1 000 mg/L硫酸鋁溶液，萌發時間為84 h，萌發溫度為25℃。在此工藝下，苦蕎種子中的總黃酮含量可以達到1 347．1 mg/100 g DW，比未萌發種子中的含量增加了135．38%。

表3 結果方差分析表

由于在種子浸種吸水的過程中運用了金屬離子鹽溶液浸種，因此分別對正交中3種離子的最優結果即最佳條件所得樣品、9號樣品和4號樣品進行了Al、Cu和Zn元素殘留量的測定。結果表明，最佳條件所得樣品中Al元素殘留量為13．110 mg/kg，9號樣品中Cu元素殘留量為8．096 mg/kg，4號樣品中Zn元素殘留量為44．07 mg/kg，均小于GB 2760—2011［22］和NY 861—2004［23］中Al、Cu、Zn元素的限量(分別為100，10，50 mg/kg)。因此，使用這3種金屬鹽離子浸種萌發不但使苦蕎中的功能性物質總黃酮含量大幅度增加，而且并未使其中Al、Zn和Cu元素含量超標。

3 討論與結論

苦蕎種子在萌發12 h后均吸水膨脹，偶有露白，12～24 h中大部分種子有出芽現象，芽長約0．2 cm。相較于水浸種萌發，一定濃度的鹽溶液浸種萌發對苦蕎種子的發芽勢和發芽率沒有顯著的影響，但對于種子芽體生長的影響較為顯著，其中鋁離子浸種后萌發的效果最好，鋅與銅的效果次之。但是，過高的鹽溶液濃度可能由于其本身毒性過大而對苦蕎的萌發起到一定的抑制作用，從而使苦蕎中的發芽率和芽苗產量降低，而過低的鹽溶液濃度有可能因有效元素含量過低而對其萌發的影響不顯著［24］。因此，浸種鹽液的濃度還需進一步研究。

經鹽溶液浸種后的苦蕎種子在萌發0～4 d內蛋白質含量比水浸種中含量增加速度慢。但在4～7天，經水浸種的種子中的蛋白質含量由第4天的最大值開始隨時間增加而下降，而經鹽溶液浸種后的種子中含量則以不同速度增加，并且分別在第6天和第7天達最大值。由此可見，相較于水浸種，金屬鹽離子浸種可使苦蕎種子在萌發中后期蛋白質含量顯著增加，但其蛋白構成的變化及其消化率則需做進一步研究。

對比多種不同濃度的鹽溶液的浸種萌發效果，由此可以確定各種鹽溶液的最佳濃度，3種鹽溶液的最佳萌發濃度分別為:硫酸鋁溶液1 000 mg/L，硫酸鋅溶液500 mg/L，硫酸銅溶液60 mg/L。經正交分析后，得出的最佳萌發工藝條件為:浸種鹽種類為1 000 mg/L硫酸鋁溶液，萌發時間為84 h，萌發溫度25℃。在此工藝下，苦蕎種子中總黃酮含量可以達到1 347．1 mg/L，比未萌發種子中的含量提高了135．38%，與傳統水浸中萌發后含量提高了27．45%。同時對樣品中的鋁、銅、鋅元素殘留量進行檢測，與國標限量相比并未超標。

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Effect of Metallic Ions on Germination and Seedlings Physiology and the Content of Flavones in Black Tartary Buckwheat

Li Xiaodan Wang Li Wang Ren Chen Zhengxing
(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology/Jiangnan University，Wuxi 214122)

The influence of aluminum，zinc and copper on the seedling physiology，crude protein and total flavones of black tartary buckwheat was studied．Absorptiophotometry was applied to determine the content of total flavones in black tartary buckwheat through L9(34)orthographic experiments．The result showed that the effect of Al，Zn and Cu solution played a notable role in the length and the content of protein of the seeds increasing during the germination stage，whereas had few influences on seed germination and its rate;based on the consequences of the single factor and orthographic experiments，the best germination processing parameter was ascertained as follows:the steeping solution 1 000 mg/L aluminum sulfate solution，germination time 84 h，temperature 25℃．In the above－mentioned condition，the content of total flavones in black tartary buckwheat would increase to 1 347．1 mg/100 g(DW)．

back tartary buckwheat，germination，protein，total flavones

S517

A

1003－0174(2012)10－0026－06

2012－12－20

李曉丹，女，1988年出生，碩士，糧食油脂及植物蛋白

陳正行，男，1960年出生，教授，谷物化學