藥品微生物限度檢查法中幾種樣品前處理方法的可行性研究

周 劍，李 霞（重慶市食品藥品檢驗所，重慶 401121）

藥品微生物限度檢查法中幾種樣品前處理方法的可行性研究

周 劍＊，李 霞（重慶市食品藥品檢驗所，重慶 401121）

目的：考察藥品微生物限度檢查法中幾種樣品前處理方法的可行性。方法：采用《中國藥典》中提供的非水溶性供試品的萃取法以及具抑菌活性供試品的離心沉淀法對8種標準菌株進行回收率試驗。結果：8種菌株采用萃取法進行前處理后，有3種菌株回收率約為100%，另外5種菌株的回收率約為70%；采用離心沉淀法前處理后，白色念珠菌回收率均低于30%，黑曲霉回收率約為30%，其余6種菌株，當樣品中不含輔料或含有可溶性輔料時，對其回收率影響不大，當樣品中含有不溶性輔料時，其回收率均低于70%。結論：在藥品微生物限度檢查法時建議根據不同樣品的抑菌活性等選擇性采用相應的前處理方法。

微生物限度檢查；樣品前處理方法；可行性

微生物限度檢查目前在國外越來越受到重視，每版藥典收載的品種也越來越多，如《美國藥典》（USP）24版收載微生物限度品種（217個）較23版（150個）增加67個。2010年版《中國藥典》對微生物限度檢查法也進行了一定的改動，其中對樣品的前處理方法作了較為詳細的規定[1]。但由于某些供試品本身具有抗菌或抑菌活性，由此可影響檢驗結果的準確性。而通過供試品前處理，可以去除樣品的抑菌活性從而更好地對該藥品的細菌、霉菌、酵母菌以及相應控制菌進行檢測，避免了因采用常規方法檢測控制菌或菌落數時，由于樣品的抑菌特性，而難以直接檢出細菌從而得出“陰性”或計數偏低的“合格”結論的情況。對供試品所進行的前處理方法，對樣品本身所含微生物是否有影響，目前還沒有系統的試驗數據去支持，為此，筆者特采用2010年版《中國藥典》中針對非水溶性供試品的萃取法以及針對具抑菌活性供試品的低速離心沉淀法[1]對8種標準菌株進行了回收率試驗，從而為藥品微生物限度檢查法中幾種樣品前處理方法的應用提供依據。

1 儀器與材料

離心機、生化培養箱（重慶永生實驗儀器有限公司）。

十四烷酸異丙酯（批號：20091002）、淀粉（批號：20091221）、微晶纖維素（批號：20091103）、蔗糖（批號：20091028）均由國藥集團化學試劑有限公司提供。

試驗菌：金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、生孢梭菌[CMCC（B）64941]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50094]、黑曲霉[CMCC（F）98003]均由中國食品藥品檢定研究院提供。

2 方法與結果

2.1 菌懸液制備

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，30～35℃培養18～24h；接種白色念珠菌和黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，白色念珠菌23～28℃培養24～48h，黑曲霉23～28℃培養5～7d。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌（或孢子）數為5000～10000cfu的菌懸液。

2.2 萃取法處理后的菌回收率試驗

取無菌十四烷酸異丙酯20mL加入5000～10000cfu的試驗菌，充分振搖，然后加入45℃的pH 7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（以下簡稱緩沖液）100mL，振搖5～10min，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水層作為供試液。取供試液1mL分別注入平皿中，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。另取上述試驗菌，直接加入緩沖液100mL作為對照溶液，測定所加的試驗菌數。上述試驗平行進行3次，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率（萃取處理后菌落數/對照溶液菌落數×100%），結果見表1。

表1結果顯示，萃取法處理對白色念珠菌、乙型副傷寒沙門菌、黑曲霉回收影響較小（回收率可達100%左右）；對其余5種菌回收影響較大（回收率只能達到70%左右），不能完全萃取。

2.3 離心沉淀法處理后的菌回收率試驗

2.3.1 不加輔料的離心沉淀法處理后的菌回收率試驗。取緩沖液10mL，加入500～1000cfu的試驗菌，500r·min－1離心5min，取全部上清液，補液至10mL，作為供試液。取供試液1mL分別注入平皿中，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。另取緩沖液10mL，加入上述試驗菌，搖勻后直接作為對照溶液，測定所加的試驗菌數。上述試驗平行進行3次，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率（離心沉淀處理后菌落數/對照溶液菌落數×100%），結果見表2。

表1 萃取法處理后的菌回收率Tab 1 Results of bacteria recovery rate after extraction

表2 不加輔料的供試液離心沉淀法處理后的菌回收率Tab 2Results of bacteria recovery rate of test solution without excipient after centrifugal precipitation

由表2結果顯示，離心沉淀法處理會造成白色念珠菌、黑曲霉大量被處理掉，回收率均遠低于70%；而對其余6種菌回收影響較小。

因采用不加輔料的離心沉淀法處理時對上清液沒有明確的界定，在提取過程中易出現偏差，故另對白色念珠菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及銅綠假單胞菌又重復進行了3次回收率試驗。測得其回收率分別為白色念珠菌：18%、19%、18%，平均值18%；大腸埃希菌：92%、89%、97%，平均值93%；金黃色葡萄球菌：74%、73%、69%，平均值72%；枯草芽孢桿菌：91%、88%、88%，平均值89%；銅綠假單胞菌：94%、89%、93%，平均值92%。與前面試驗結果基本一致，進一步驗證了試驗的重復性較好。

2.3.2 加輔料的離心沉淀法處理后的菌回收率試驗。由于口服的固體制劑中除主藥外，實際還含有大量的輔料，這些輔料一般難溶于水，故進行微生物限度檢查時，樣品中實際是含有大量不溶性物質的。為了考察這些輔料對試驗菌回收的影響，特模擬樣品的實際狀態，操作時加入一定的輔料后作進一步試驗，考察輔料對試驗菌是否有吸附或攜帶作用。經對常用處方進行分析，初步擬訂對處方中所占比例較大的淀粉、微晶纖維素和蔗糖等3個最常見的填充劑進行加入試驗考察。

取淀粉、微晶纖維素和蔗糖各10g，分別加入緩沖液至100mL，混勻，作為1∶10的供試原液。取此原液10mL，加入500～1000cfu的試驗菌，以500r·min－1離心5min；取全部上清液，補液至10mL，作為供試液（1∶10）。取供試液1mL分別注入平皿中，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數。另取供試原液10mL，加入上述試驗菌，搖勻后直接作為對照溶液，測定所加的試驗菌數。上述試驗平行進行3次，分別計算各試驗菌每次試驗的回收率（離心沉淀處理后菌落數/對照溶液菌落數×100%）以及平均回收率，結果見表3。

表3 含不同輔料的供試液采用離心沉淀法處理后的菌平均回收率（%%）Tab 3 Results of average bacteria recovery rate of test solution with different excipients after centrifugal precipitation（%%）

由表3結果顯示，加入蔗糖對具抑菌活性供試品如采用離心沉淀法進行前處理，白色念珠菌、黑曲霉無論在含淀粉類、微晶纖微素類、蔗糖類或不含輔料時，其回收率均遠低于70%；供試品中如含有不溶性的輔料如淀粉或微晶纖微素，試驗菌中除銅綠假單胞菌的回收率略高于70%以外，其余7種菌株的回收率均未達到70%；供試品中如含有可溶性的輔料如蔗糖時，8種菌株的回收率反而有所升高。

3 討論

（1）由于微生物基本上是存在于水相中的，理論上說，油相中的微生物采用萃取法是可以提取出來的，但實際上，萃取法很難達到100%的回收[2]。從上述試驗就可以看出，8種試驗菌，除3種菌萃取完全外，其余5種菌的回收率都只有70%，如果按《中國藥典》標準回收率的低限限度70%計算，采用萃取法進行前處理后的菌實際回收率均約為50%左右。

（2）采用離心沉淀法進行前處理，由于存在一個沉降系數問題，而沉降系數又與菌的形態、大小等有關，因而，不同種類的菌株離心后所得回收率存在較大的差異，如白色念珠菌和黑曲霉采用此處理方法就基本上大部分被處理掉了。同時在進行離心試驗時，樣品里的不溶性物質對樣品中所含的微生物還具有一定的攜帶作用，尤其當制劑中含有不溶性輔料時，其攜帶作用更強，因此，試驗中應謹慎選擇離心沉淀法進行前處理[3]。實際工作中，有些含不溶性成分的藥品目前因無其他有效的方法消除抑菌活性而不得不采用離心沉淀法時，由于一般藥品都對真菌類微生物無抑菌活性，可以選擇采用離心沉淀法進行細菌數和控制菌的檢查，同時結合常規方法進行霉菌及酵母菌等真菌類微生物的檢查。

本試驗結果顯示，如采用萃取法和離心沉淀法對供試品進行前處理，前處理過程對樣品本身所含的微生物實際是有一定影響的，故進行樣品前處理時，應該考慮不同樣品的抑菌活性和樣品本身的性狀，選擇適宜的前處理方法，其所得試驗結果才能更為真實地反映樣品本身實際所含的微生物。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄ⅪJ.

[2] 楊 潔，嚴建國.微生物限度檢查中非水溶性液體制劑供試液的制備方法[J].中國藥業，2004，13（1）：54.

[3] 袁林娜，宋 勤.微生物限度檢查法中低速離心法回收細菌、真菌試驗方法的研究[J].藥物分析雜志，2007，27（10）：1620.

Feasibility of Pretreatment Methods of Samples in the Microbial Limit Test

ZHOU Jian，LI Xia（Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing 401121，China）

OBJECTIVE：To study the feasibility of pretreatment methods of samples in the microbial limit test.METHODS：8kinds of standard strains were adopted for recovery test by extraction method for non-water soluble sample and by centrifugal precipitation method for test sample with anti-bacterial activity according to Chinese Pharmacopoeia.RESULTS：After extraction，the recovery rate of 3kinds of strains were found to be about 100%and that of other 5strains about 70%.After centrifugal precipitation，the recovery rate of Candida albicans was found to be less than 30%and Aspergillus niger was found about 30%.For other 6kinds of strains，the recoveries would hardly be influenced if there was no excipient or dissoluble excipient in the sample；but that would be less than 70%if there was insoluble excipient in samples.CONCLUSION：Pretreatment methods in the microbial limit test should be applied selectively according to the anti-bacterial activity of samples.

Microbial limit test；Pretreatment methods of samples；Feasibility

R927.1

A

1001-0408（2012）33-3136-02

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.33.25

＊工程師。研究方向：藥品、食品及醫療器械微生物檢查。電話：023-86072731。E-mail：zhoujian_1980101@163.com

2011-09-07

2011-10-16）