局灶性腦缺血大鼠預處理后CHOP mRNA及其蛋白的表達☆

胡躍強 唐農 董少龍 劉尊敬 祝美珍 胡玉英 范立雷

腦缺血預處理（brain ischemic preconditioning，BIP）是近年發現的重要內源性神經保護機制，可使腦組織對以后較長時間的缺血性損傷產生顯著的耐受［1］。最近有研究發現內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在此環節中發揮了關鍵作用，其中 C／EBP 同源蛋白（C／EBP homology protein，CHOP）表達的增加是ERS的標志之一，它參與了細胞凋亡的過程［2］。本研究意在通過檢測局灶性BIP后CHOPmRNA及其蛋白在腦內的表達變化，以進一步研究BIP的神經保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組與處理 健康雄性SD大鼠180只，體質量（250±50）g，隨機將大鼠分為3組：假手術組（SO）、大腦中動脈缺血組（MCAO）、腦缺血預處理組（BIP）。 每組按照再缺血后 12 h、1 d、2 d、3 d四個時間點平均分為4個亞組（n=15）。分別作如下處理：SO組：以假手術代替預缺血及缺血再灌注；MCAO組：以假手術代替預缺血，其余步驟同BIP組；BIP組：MCAO 10 min后抽出栓線，完成預缺血，3 d后再次行MCAO 2 h，再灌注后12 h、1 d、2 d、3 d 處死大鼠。

1.2 動物模型與標本制備 參照Longa的線栓法進行造模。采用大腦中動脈二次線栓法［3］制備大鼠腦缺血預處理模型，結扎左側頸外動脈遠端，在結扎線近端距分又5 mm處剪口，將尼龍線從頸外動脈殘端插入至頸總動脈分叉部以上19～20 mm，結扎頸外動脈近心端，10 min后抽出栓線，完成缺血預處理。3 d后再次行MCAO 2 h，再灌注后規定時間點處死動物取腦。

1.3 缺血半暗帶腦皮質 CHOP mRNA表達測定 原位雜交法。按試劑盒說明進行操作。采用HMIAS?2000高清晰彩色病理圖像分析系統測定CHOP mRNA原位雜交染色的灰度值。主要在頂葉缺血半暗帶陽性細胞做比較，染色越深，灰度值越小，mRNA表達越多。每張切片測定4個視野（400×），取平均值。

1.4 缺血半暗帶腦皮質內CHOP蛋白表達測定 大鼠斷頭取腦并分離缺血側頂葉大腦皮質約100 mg，研磨后加入蛋白裂解液，然后4℃12000 r／min 離心 30 min，提取總蛋白，取蛋白樣品 40 μg經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，然后電轉移至PVDF膜上。然后依次加入兔抗CHOP抗體（Bioworld公司），4℃ 孵育過夜；偶聯有辣根過氧化物（HRP）羊抗兔IgG（Amersham公司）室溫孵育2 h，滴加ECL顯色液，Bio?Rad凝膠成像儀曝光、顯像。采用HMIAS?2000高清晰度彩色病理圖文分析系統進行圖像分析，獲取各組Western blot條帶的平均光密度（OD）值，內參為GAPDH，目的蛋白與內參光密度比值即為目的蛋白的相對值。

1.5 神經細胞凋亡率檢測 大鼠迅速斷頭取腦，分離缺血半暗帶腦組織100 mg，1.25 g／L胰蛋白酶消化后制備單細胞懸液，70%乙醇4℃過夜固定樣品，次日離心棄乙醇收集細胞，加入50 mg／L RNase，37℃孵育 30 min，再加入 50 mg／L PI（美國 KPL 公司），4℃避光染色30 min，300目篩網過濾，利用美國貝克曼-庫爾特FC 500流式細胞儀計數10000個細胞，測定各期細胞DNA含量并計算凋亡細胞所占比例。

1.6 統計學方法 采用SPSS13.0處理數據。所有數據以表示，組間比較用方差分析進行檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 CHOP mRNA表達變化 原位雜交顯示：SO組有少量CHOP mRNA表達；MCAO組大鼠腦缺血再灌注后12 h缺血半暗帶CHOP mRNA表達達高峰（P＜0.01），隨再灌注時間延長其表達逐漸下降，但仍保持較高表達水平 （P＜0.01）；BIP組缺血后各時間點其表達水平較MCAO組均明顯下降（P＜0.05）。 見表 1、圖 1。

表1 大鼠頂葉皮層CHOP mRNA表達的灰度值

圖1 缺血半暗帶CHOP mRNA的表達（原位雜交）

2.2 CHOP蛋白表達的變化 Western blot顯示：SO組有少量CHOP蛋白表達；MCAO組12 h缺血半暗帶CHOP蛋白表達開始顯著增加，24 h達高峰（P＜0.01），隨再灌注時間延長其表達逐漸下降，但仍保持較高表達水平（P＜0.01）；BIP組缺血各時間點其表達水平均顯著降低（P ＜ 0.05，P ＜ 0.01）。見表 2、圖 2。

表2 大鼠頂葉皮層CHOP蛋白表達的光密度值

圖2 CHOP蛋白的表達（Western blot）

2.3 神經細胞凋亡率變化 流式細胞術細胞周期定量分析表明，SO組未見明顯的凋亡峰，其細胞凋亡百分率很低。腦缺血再灌注12 h后，MCAO組缺血半暗帶細胞凋亡發生率較SO組顯著增加（P＜0.01），1 d時達到高峰，以后時間點逐漸下降，但仍高于SO組（P＜0.01）；BIP組各個時間點神經元凋亡發生率較MCAO組顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。說明BIP具有減輕腦缺血再灌注后神經元凋亡的作用。見表3。

3 討論

腦缺血預處理（BIP）是指對腦組織采用機械刺激，如一次或多次短暫性腦缺血再灌注后，誘導腦組織產生內源性保護機制，使其對以后較長時間的缺血性損傷產生顯著的耐受，這種現象又稱為腦缺血耐受。最近有研究發現BIP可激發適當的內質網應激（ERS），增強細胞耐受后繼長時間缺血刺激的能力，延緩或減輕I／R造成的組織損傷，并認為ERS可能是腦缺血細胞損傷的關鍵環節［4］。腦缺血后ERS激活并可誘導CHOP／Gadd153等未折疊蛋白反應 （UPR）靶基因在缺血后表達［5］，引起細胞凋亡。其可能機制如下：①內質網跨膜蛋白IRE1和ATF6活化［6］，其胞漿活性部分進入核內，與ERS反應元件相連，啟動CHOP轉錄與表達［7］；②通過PERK-eIF2a途徑活化，導致轉錄因子ATF4和ATF3表達，前者結合氨基酸調控元件，再誘導CHOP表達。CHOP可能通過下調Bcl-2表達、耗竭谷胱甘肽、促進活性氧族產生等，活化Caspase-12，最終導致細胞凋亡［8］。CHOP基因敲除可增強細胞對抗ERS所致凋亡的能力；相反，CHOP過度表達的細胞則對ERS所致凋亡更為敏感。

表3 各組大鼠神經細胞凋亡率

己有研究在腦缺血再灌動物模型中檢測出CHOP表達增加。如Yuan等［9］制作大鼠短暫性全腦缺血模型，阻斷腦血流30 min后再灌注，結果顯示再灌注6 h至24 h大腦皮層缺血半暗帶CHOP蛋白表達逐漸增加，再灌注24 h達高峰；Jin等［10］利用微陣列分析技術發現大鼠海馬部位CHOPm?RNA 在再灌注 4 ～ 24 h 表達增加；Tajiri等［11］將野生型及CHOP-／-小鼠制成永久性腦缺血模型，檢測CHOPmRNA及其蛋白在野生型小鼠紋狀體及海馬的表達以，實驗發現術后12 h CHOPmRNA表達顯著增加，術后24 h在受損神經元胞核內檢出CHOP蛋白表達，而CHOP-／-小鼠7 d后海馬和紋狀體的神經細胞死亡較對照組有實質性的減少，這些結果均說明缺血誘導的神經細胞死亡與CHOP有關。

本研究發現，腦缺血120 min再灌12 h缺血側頂葉皮層CHOPmRNA表達達高峰，隨再灌注時間延長其表達逐漸下降，再灌注72 h仍可見其高表達，其蛋白表達于再灌24 h達高峰，提示大鼠缺血再灌注（ischemia／reperfusion，I／R）損傷誘發的ERS可誘導CHOP的表達。與相關研究報道基本一致［9-10］。結合神經細胞凋亡率在I／R后1 d時達到高峰，提示I／R后CHOP表達上調促進了細胞凋亡。而BIP干預后其表達均有明顯的下降，提示BIP可能通過影響ERS后CHOP的表達而抑制細胞凋亡，從而保護神經細胞。其機理有待于進一步研究。

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