化癥散積顆粒對小鼠原位肝癌Bcl－2／Bax表達的影響

金學洙，李超英，周 磊，邢美茜，劉鐵軍

（長春中醫藥大學附屬醫院 肝病科，吉林 長春130021）

本實驗通過建立小鼠原位肝癌模型，研究Bcl－2／Bax基因在化癥散積顆粒誘導小鼠原位肝癌發生凋亡過程中的作用與機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 IMDM培養基、新生牛血清購自Gibco公司；TUNEL原位末端凋亡檢測試劑盒購自羅氏公司；Tizol mRNA提取試劑和逆轉錄酶購自Invitrogen公司；PCR試劑盒購自TAKARA公司；Bcl－2和Bax抗體購自Senta公司；引物合成由上海生工完成；化癥散積顆粒由長春中醫藥大學藥物制劑研究室提供；陽性藥物對照：復方斑蝥膠囊購自貴州益佰制藥股份有限公司（批號：Z52020238）；鼠源性腹水型肝細胞癌細胞株H22（吉林省腫瘤研究所提供）；實驗動物均購自吉林大學白求恩醫學院實驗動物研究所，昆明種小白鼠，4－6周齡，體重22－25g，雌雄各半。

1.2 細胞培養和傳代 鼠源性腹水型肝癌H22細胞由本實驗室常規培養于含10%新生牛血清的IMDM培養基中，37℃、5%的CO2培養箱中，經小鼠腹腔傳代后備用。

1.3 小鼠原位肝癌模型的建立 取腹腔接種H22肝癌細胞株后7d的昆明種小鼠，無菌抽取H22肝癌細胞株腹水，生理鹽水洗滌，離心1 000r／min，5 min棄上清，臺盼藍染色計數，生理鹽水調整癌細胞數至1×108／ml備用。健康昆明種小鼠，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，小鼠仰臥固定，備皮，常規消毒鋪巾，于上腹正中劍突下作一約1cm的切口。輕壓雙側肋弓以擠出部分肝葉，濕紗布墊于肝葉下方以保護，然后用0.25ml醫用注射器針頭沿肝葉長軸方向插入緩慢注入H22肝癌細胞懸液0.03ml（細胞數為3×106）。在拔出針頭的同時，迅速用棉簽輕壓1min止血，然后在針眼周圍用酒精棉球輕搽。小心地將肝臟回納入腹腔，縫合切口術畢。術后正常飲水、進食［3］。

1.4 動物分組及給藥 將瘤源小鼠分為5組，每組10只。實驗分組如下：A.陽性對照組（簡稱斑蝥組或FB）B.模型組（簡稱mock）；C.低劑量治療組（簡稱Low）；D.中劑量治療組（簡稱 Medium）；E.高劑量治療組（簡稱High）；化癥散積顆粒低、中、高用法為：1.95g／kg，3.9g／kg，7.8g／kg，灌胃1次／d，治療組連續14d，復方斑蝥膠囊用法為：0.19g／kg，灌胃1次／d，14次。模型組生理鹽水每天灌胃1次，連續14d，于末次給藥后24h，頸椎脫臼法處死小鼠，取腫瘤組織。

1.5 凋亡細胞的TUNEL檢測 按試劑盒說明書操作。熒光顯微鏡下成像，激發波長為450－500 nm，檢測波長為515－565nm（綠色熒光）。按說明書設立陰性對照。200倍視野下選取5個視野，計算并比較腫瘤組織原位細胞凋亡率。

1.6 RT－PCR 檢測 Bcl－2和 Bax的 mRNA 表達給藥后取新鮮腫瘤組織，按照試劑盒說明書提取總mRNA，逆轉錄成cDNA。采用cDNA為模板，分別用Bcl－2、Bax和β－actin引物進行 PCR 反應，30個循環后取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，采用天能凝膠成像系統拍照并分析條帶吸光度，實驗重復3次。結果以目的基因和內參基因β－actin比值表示。各引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.7 Western－blot檢測 Bcl－2、Bax的蛋白表達按試劑盒說明書操作。DAB法顯色。膜采用天能凝膠成像系統拍照并進行條帶吸光度分析，實驗重復3次，結果以目的蛋白和內參蛋白β－actin比值表示。

1.8 統計學分析 采用SPSS 11.0軟件對實驗結果數據進行統計分析。實驗結果采取均數±標準差（±s）表示。P＜0.05表示有統計學差異。

2 結果

2.1 TUNEL染色檢測晚期凋亡細胞 如圖1所示，在熒光顯微鏡下觀察肝癌組織原位的細胞凋亡情況，凋亡細胞被染成綠色，通過對5個不同視野的凋亡細胞計數，結果顯示，FB、Medium和High組細胞凋亡率均明顯增加，與對照組相比具有明顯差異（P＜0.05，n＝5），而Low組雖然可以觀察到凋亡細胞但是其細胞計數與對照組相比無明顯差異（P＞0.05，n＝5）。

圖1 熒光顯微鏡下的TUNEL染色結果（×200）和凋亡細胞計數統計

2.2 RT－PCR檢測Bcl－2和Bax mRNA表達 如圖2所示，通過對以β－actin作為內參校正后條帶進行密度掃描分析，可以發現在斑蝥組、中劑量和高劑量組的腫瘤組織中的Bcl－2mRNA表達水平明顯低于模型組（P＜0.05），Bax mRNA水平則明顯高于模型組（P＜0.05）；低劑量組Bcl－2和Bax mRNA水平與模型組相比稍高，但無統計學差異（P＞0.05）。

圖2 RT－PCR檢測不用給藥組腫瘤組織中Bcl－2和Bax的mRNA表達

2.3 Western－blot檢測Bcl－2和Bax蛋白表達

如圖3所示，腫瘤組織中的Bcl－2蛋白表達在FB、Medium和High組中表達明顯低于模型組和Low組（P＜0.05），Bax在FB、Medium和 High組中表達明顯高于模型組（P＜0.05），Low組與模型組相比無明顯差異。通過上圖我們可以看出，Bcl－2／Bax蛋白表達的比值在不同組也有差異，其中FB、中劑量組和高劑量組比值明顯小于模型組（P＜0.05），而低劑量組比值與模型組無明顯差異（P＞0.05，n＝5）。

圖3 Western－blot檢測不同給藥組Bcl－2和Bax的蛋白表達

3 討論

細胞凋亡或程序性細胞死亡是細胞在一定的生理或病理條件下遵循自身的程序“自殺”，最后脫落離體或形成多個凋亡小體被其它細胞吞噬。誘導凋亡是目前藥物治療腫瘤的重要方向和方法。實驗中我們通過TUNEL染色法檢測了不同給藥組和模型組的細胞凋亡情況，結果發現模型組腫瘤細胞只發現很少凋亡細胞，而斑蝥組、中劑量組和高劑量組腫瘤細胞凋亡明顯增加，且對照組相比具有明顯差異（P＜0.05，n＝5），但是低劑量組凋亡細胞與對照組相比無明顯差異（P＞0.05）。

Bcl－2家族蛋白是一組與細胞凋亡密切相關蛋白，其產物主要定位于細胞質膜如線粒體膜、核周膜和內質網。Bcl－2具有凋亡拮抗作用。Bax的細胞內定位與Bcl－2類似，限于部分細胞核膜、線粒體外膜及內質網膜、胞漿。其作用與Bcl－2促細胞存活（抗凋亡）的作用相反，Bax基因可以促細胞發生凋亡［4，5］。生物學研究已經 證實 Bcl－2 與 Bax 在體內形成同或異二聚體而發揮抗凋亡作用。本實驗首先應用免疫組織化學染色的方法定位檢測了Bcl－2和Bax在各組腫瘤細胞中的表達情況，結果顯示Bcl－2在模型組腫瘤細胞中高表達，低劑量組表達與模型組相比無明顯差異，而斑蝥組、中劑量和高劑量組腫瘤細胞中的Bcl－2則呈低表達；Bax表達情況與Bcl－2完全相反，在模型組和低劑量組中低表達，而在斑蝥組、中劑量以及高劑量組腫瘤細胞胞漿中高表達。同時我們通過RT－PCR的方法檢測了Bcl－2和Bax在mRNA水平即轉錄水平的表達變化，結果顯示通過對以β－actin作為內參校正后條帶進行密度掃描分析，可以發現的腫瘤組織中的Bcl－2mRNA水平在FB、Medium和High組明顯低于模型組（P＜0.05），Bax mRNA水平則明顯高于模型組；低劑量組Bcl－2和Bax mRNA水平與模型組相比稍高，但無統計學差異（P＞0.05）。Bcl－2與Bax mRNA和蛋白表達濃度的比值趨勢一致，斑蝥組、中劑量和高劑量組明顯低于模型組和低劑量組。結果說明Bcl－2在轉錄水平上表達減少，而Bax在轉錄水平表達增多，這種改變可能促進細胞引發凋亡級聯反應。

通過以上實驗從原位肝癌小鼠給藥實驗證明了，化癥散積顆粒可抑制腫瘤生長并誘導腫瘤細胞發生凋亡。在研究腫瘤生長抑制機制的過程中，我們從細胞凋亡入手，探討了凋亡相關基因Bcl－2和Bax的表達改變，證明化癥散積顆粒可能是通過減少抑制凋亡基因Bcl－2表達，同時增加促凋亡基因Bax表達誘導腫瘤細胞發生凋亡。

［1］ParkinDM，BrayF，FedayJ，et al.Global caneer statisties，2002［J］.Cancer J Clin，2005，55（2）：74.

［2］Parkin FDM.Global cancer statistics in the year 2000［J］.Lancet Oncol，2001，2（9）：533.

［3］李超英，楊春榮，張大方，等.彩超應用于小鼠原位肝癌移植模型的評價［J］.中華中醫藥雜志.2008，23（12）：1064.

［4］Pan G，O＇rourk e K，Dixit VM.Caspsae－9，Bcl－Xl，an d Apaf－1format ernary complex［J］.J Biol Chem，1998，273：5841.

［5］Hu Y，Benedi ct M A，Wu D，et al.Bcl－XL interact s with Apaf－1 and inhibits［J］.Proc Natl Acad Sci，1998，95：4386.