槲寄生堿體外通過激活Caspase8誘導(dǎo)ACC細(xì)胞的凋亡

邱心如，周洪瀾，李亞娟，張麗紅，翟穎仙，王醫(yī)術(shù)＊

（1.吉林大學(xué)a.藥學(xué)院2009級；b.第一醫(yī)院；c.病理生物學(xué)教育部重點實驗室，吉林 長春130021；2.四平市中心人民醫(yī)院）

唾液腺腺樣囊性癌 （salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是最常見的唾液腺惡性腫瘤之一，大約占唾液腺惡性腫瘤的20%［1］。近年來，槲寄生Viscum Coloratum（Kom.）Nakai的抗癌作用受到國內(nèi)外醫(yī)藥學(xué)界的極大重視。在亞洲，韓國對槲寄生抗癌作用的研究較多，他們主要提取槲寄生的外源凝集素（Lectins）作抗癌研究［2，3］。在我國，早在1994年王慶瑞等人就曾經(jīng)報道，槲寄生的總生物堿具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，是槲寄生中有效的抗腫瘤成分之一［4］。Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用［5，6］?；诖?，本實驗主要研究槲寄生堿作用ACC細(xì)胞后，Caspase家族中關(guān)鍵因子Caspase8的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 材料

藥物及試劑：槲寄生堿粉末由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥化實驗室制備；新生牛血清購于TBD公司；RPMI1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶購于美國Gibco公司；5－氟尿嘧啶購自天津金耀氨基酸公司；ACC細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。Caspases8多克隆抗體購于Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 槲寄生堿的配制 根據(jù)文獻(xiàn)采用稀鹽酸浸提法［1］提取，用 NaOH 將pH 值調(diào)至6.5左右，制成槲寄生堿溶液，濃度為1mg／ml。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) ACC細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液中，培育在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，達(dá)到對數(shù)生長期后，進(jìn)行實驗分組：①對照組：未用槲寄生堿處理的正常生長細(xì)胞；②陽性對照組：采用5-FU處理ACC細(xì)胞；③實驗組：采用槲寄生堿（2.24μg／ml）處理 ACC細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞爬片 加藥后立即將細(xì)胞（5×104／ml）接種于已經(jīng)鋪好蓋玻片的24孔板內(nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)24小時后0.1%PBS沖洗，10%中性福爾馬林固定，于－20℃冷藏備用。

1.2.4 caspase8活性的檢測 免疫組織化學(xué)染色采用SP法。

2 結(jié)果

2.1 Caspase8的表達(dá)情況

Caspase8免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，槲寄生堿作用組ACC細(xì)胞胞漿有棕黃色顆粒，呈陽性表達(dá)，并且隨著堿濃度的升高，表達(dá)增強(qiáng)。陽性率高于5-FU組（P＜0.001），未加藥組細(xì)胞胞漿無明顯棕黃色反應(yīng)物（P＜0.001）（結(jié)果見表1，圖1）。

表1 ACC細(xì)胞Caspase8表達(dá)的IOD值（±s）

表1 ACC細(xì)胞Caspase8表達(dá)的IOD值（±s）

各組間比較P＜0.001

組別 劑量（μg／ml） IOD值－ 168818.2±11592.21槲寄生堿組 2.24 723574.7±8007.34 5-FU 組未加藥組111.90 664603.9±8540.64

圖1 ACC細(xì)胞Caspase8的表達(dá)（100×）

3 討論

細(xì)胞的凋亡涉及到一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控，其過程大體上可以分為三個階段［7］：接受凋亡相關(guān)信號→整合信號，凋亡調(diào)控分子間相互作用→蛋白水解酶（Caspase）激活，進(jìn)入不可逆的連續(xù)反應(yīng)過程。在不同的凋亡途徑當(dāng)中，天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（cysteinylaspartate specific protease，Caspase）發(fā)揮了關(guān)鍵性作用［8］。文獻(xiàn)顯示，在死亡受體途徑中，細(xì)胞膜上的Fas被激活后，將凋亡信號傳導(dǎo)入胞內(nèi)，自身形成三聚體，通過DD（death domain，死亡結(jié)構(gòu)域）與FADD（Fas associated protein with death domain，F(xiàn)as相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白）結(jié)合，而FADD中含有的 DED（death effected domain，死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域）是Caspase8中CARD（Caspase activation and recruitment domai，Caspase激活募集結(jié)構(gòu)域）的一種，從而使procaspase8自身水解活化，進(jìn)一步去激活Caspase3來促進(jìn)細(xì)胞的凋亡［9］。誘導(dǎo)Caspase8才能實現(xiàn)其凋亡過程。李鋼琴等人在實驗中證實丹皮酚即是通過上調(diào)Fas、Caspase8的表達(dá)來誘導(dǎo)大腸癌HT－29細(xì)胞的凋亡［10］。韓陽等人亦在實驗中證實Caspase8在死亡受體途徑中第一步被激活，進(jìn)而活化下游的Caspase來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11］。

基于此，本實驗研究的目的是槲寄生堿作用SACC后觀察caspase8表達(dá)情況，結(jié)果顯示Caspase8免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，槲寄生堿作用組ACC細(xì)胞胞漿有棕黃色顆粒，呈陽性表達(dá)，并且隨著堿濃度的升高，表達(dá)增強(qiáng)。陽性率高于5-FU組（P＜0.001），未加藥組細(xì)胞胞漿無明顯棕黃色反應(yīng)物（P＜0.001）。因此，可以認(rèn)為槲寄生堿通過Caspase8誘導(dǎo)ACC細(xì)胞凋亡，槲寄生堿有可能成為一種治療腺樣囊性癌的有效藥物，它的研制與開發(fā)利用，將為人類攻克腫瘤這一頑疾開辟一條新的道路。

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［3］Taek Joon Yoon，Yung Choon Yoo，Tae Bong Kang，et al.Cellular and humoral adjuvant activity of lectins isolated from Korean mistletoe（Viscum album colaratum）［J］.International Immunopharmacology，1（2001）：881.

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［6］Fang Xiaoyang，Sheng Wei.Studies on Chinese materia medica inducing tumor cells apoptosis［J］.中草藥，2004，4（34）：472.

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［9］趙 丹.FADD研究進(jìn)展［J］.國際免疫學(xué)雜志，2006，29（3）：152.

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［11］韓 陽，官大威，侯震寰，等.caspase-8及其研究進(jìn)展［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2006，21（2）：94.