苯并(a)芘對體外培養人淋巴細胞免疫活性和HSP70的影響

單士剛,包永芬

(湖北科技學院基礎醫學院,湖北 咸寧 437100)

有害性多環芳烴化合物,如苯并(a)芘[benzo(a)pyrene,B(a)P]是普遍存在的環境污染物,主要來源于香煙和含碳有機物的不完全燃燒.B(a)P不僅對機體呼吸系統有影響,而且還可以損傷免疫系統,對人類健康的影響主要表現在遺傳損傷、致癌和免疫毒性等[1].目前認為B(a)P對機體的損傷可能與代謝和細胞毒性之間有一定的關系.其中重要的途徑可能是代謝活化、引發自由基和氧化應激以及干擾細胞第二信號傳導網絡的正常運行等,從而影響細胞的活性,最終導致機體的損傷[2-4].本實驗以體外培養的淋巴細胞株為研究對象,不同濃度B(a)P(0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L)染毒16 h,分別用MTT(四甲基氮唑藍,methylthiazolyltetrazolium)法、Elisa和Western blot法檢測淋巴細胞細胞活力、細胞因子分泌以及熱休克蛋白70(heat shock proteins70, HSP70)表達情況,為今后評估人群接觸B(a)P對免疫系統的毒性和應激作用提供實驗依據.

1 材料與方法

1.1細胞株和試劑人B細胞轉化淋巴母細胞系721.221購自武漢大學中國典型培養物保藏中心.胎牛血清、RPMI-1640培養基均為美國Gibco公司產品；MTT和B(a)P購自美國Sigma公司；IFN-α、interleukin-1α和interleukin-6 ELISA試劑盒(Pierce,美國),鼠抗人單克隆HSP70,鼠抗人β-actin單克隆,辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG (武漢博士德公司),其他試劑為國產分析純.

1.2細胞培養與染毒721.221細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基,置含5%CO2的37 ℃培養箱內培養.取對數生長期721.221細胞,設不同濃度的B(a)P染毒組(0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L)、溶劑對照組(1‰DMSO, 3‰S9)和空白對照組(含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基).

1.3MTT試驗取對數生長期721.221細胞,以每孔5.5×103個細胞接種于96孔培養板.設不同濃度的B(a)P 染毒組(0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L)、溶劑對照組(1‰DMSO, 3‰S9)和空白對照組(含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基).每組設6個復孔,培養箱中培養12 h.取出培養板,每孔加入20 μL MTT(終濃度為0.05 mg/mL),繼續培養4 h；取出培養板于1 800 r /min離心10 min,棄去上清液,每孔加入150 μL DMSO,振蕩10 min至形成的紫色結晶完全溶解,在570 nm處測定吸光度(OD值),按以下公式計算細胞生長率,以反映細胞的增殖活性.

相對光密度值(ROD)=OD實驗組/OD對照組×100%

1.4細胞因子的檢測取2×106個細胞,加入不同濃度的B(a)P (0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L),設溶劑對照組(1‰DMSO, 3‰S9)和空白對照組(含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基).每組設6個復孔.共同作用16 h后收集培養基上清,按照操作說明書用IFN-α、IL-1α和IL-6 ELISA試劑盒檢測.

1.5Westernblot法檢測HSP70蛋白表達水平收集處理后的721.221細胞,用冰裂解液裂解細胞,以Lowry 法進行總蛋白定量,50 μg樣品與上樣緩沖液混和,于8% SDS-PAGE中進行電泳,轉印至PVDF膜(孔徑0.45 μm).用含5%脫脂奶粉的緩沖液 (Tris-Buffered Saline Tween-20,TBST)封閉,37 ℃孵育1 h.TBST洗3次,10 min/次.鼠抗人HSP70用含5%脫脂奶粉的TBST按1∶400稀釋,鼠抗人β-actin單克隆抗體用含5%脫脂奶粉的TBST按1∶1 000稀釋,4 ℃孵育過夜.TBST洗滌3次,10 min /次；HRP標記羊抗鼠IgG用含5%脫脂奶粉的TBST按1∶1 000稀釋,37 ℃孵育1 h,TBST洗滌.用ECL檢測蛋白的表達,凝膠成像系統照相保存.

2 結果

2.1細胞的增殖活性圖1可見,與溶劑對照組比較,0.125、0.250、0.500、1.000 μmol/L B(a)P染毒組細胞的增殖活性均升高,差異有統計學意義(P<0.05).且隨著B(a)P染毒濃度的升高,細胞的增殖活性呈先上升后下降的趨勢,1.000 μmol/L B(a)P染毒組細胞的增殖活性達到峰值,與溶劑對照組相比,增加了40%.

圖1 不同濃度B(a)P處理細胞16 h的生長曲線與溶劑對照組比較, * P< 0. 05.

2.2細胞因子檢測由圖2(A、B)知,細胞經過B(a)P處理后,IL-1α和IL-6分泌隨著染毒濃度的增加而降低,與對照組相比有統計學意義(P< 0.05),呈現劑量-效應關系.由圖3知,細胞經過B(a)P處理后,低濃度時IFN-α分泌隨著染毒濃度的增加而增加,與對照組相比有統計學意義(P< 0.05),呈現劑量-效應關系,且隨著B(a)P染毒濃度的升高,IFN-α分泌呈先上升后下降的趨勢,1.000 μmol/L B(a)P染毒組分泌達到峰值,隨后降低.

圖2 不同濃度B(a)P處理細胞16 h后的IL-1α(A)、IL-6(B)分泌情況與溶劑對照組比較, *P<0.05.

2.3B(a)P染毒對721.221細胞HSP70表達的影響如圖4所示,不同劑量B(a)P(終濃度為0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L)作用細胞16 h后,與溶劑對照組相比,低濃度時HSP70表達隨濃度增加而增加,1.000 μmol/L達到最大值,隨后降低,呈劑量依賴性.

圖3 不同濃度B(a)P處理細胞16 h后的IFN-α分泌情況(與溶劑對照組比較, *P<0.05)

圖4 不同濃度B(a)P對淋巴細胞HSP70表達的影響(μmol/L)

3 討論

B(a)P是一種廣泛存在于環境中的具有致癌作用的多環芳烴類化合物.自Stijernsward[5]發現其對小鼠體液免疫功能有抑制作用以來,國內外學者對B(a)P的免疫毒性進行了大量的研究,結果表明B(a)P不僅具有明顯的體液免疫毒性,而且也有一定的細胞免疫毒性[6-9],從而影響細胞的正常功能.

熱應激蛋白(heat stress proteins, HSPs)是機體在各種應激因素(高溫、毒物、缺血、缺氧等)作用下, 啟動熱應激蛋白基因,選擇性合成的一組高度保守的蛋白質；其中HSP70是人們研究比較深入的一種蛋白質,它能保護機體細胞免受應激因素的損害,賦予細胞或生物從各種應激中恢復的能力和保護它們免遭這些應激因素的損害[10].細胞實驗和流行病學研究表明HSP70蛋白表達水平與DNA損傷有較強的負相關性[11-12].

本研究重點闡述了B(a)P對體外培養淋巴細胞細胞因子分泌和HSP70表達的影響,可為研究B(a)P對機體免疫毒理學和對機體應激系統的影響提供重要的實驗依據.本研究發現,與溶劑對照組比較,低劑量時(0.125、0.250、0.500、1.000 μmol/L)細胞的增殖活性均升高,差異有統計學意義(P<0.05)；且隨著B(a)P染毒濃度的升高,細胞的增殖活性呈先上升后下降的趨勢,1.000 μmol/L B(a)P染毒組細胞的增殖活性達到峰值,與溶劑對照組相比,增加了55%,差異有統計學意義(P<0.05).隨著染毒劑量(2.000、4.000、8.000、16.000 μmol/L)的增加,B(a)P顯著抑制細胞活力.細胞經過B(a)P處理后,IL-1α和IL-6分泌隨著染毒濃度的增加而降低,與對照組相比有統計學意義(P< 0.05),呈現劑量-效應關系.低濃度時IFN-α分泌隨著染毒濃度的增加而增加,與對照組相比有統計學意義(P<0.05),呈現劑量-效應關系；且隨著B(a)P染毒濃度的升高,IFN-α分泌呈先上升后下降的趨勢,1.000 μmol/L B(a)P染毒組分泌達到峰值,隨后降低.本研究發現隨著B(a)P染毒濃度的升高,HSP70的表達呈現先升高后降低的趨勢,結果提示B(a)P在低濃度時可以引起細胞的應激體系,降低B(a)P對細胞造成的損傷,高劑量時B(a)P對淋巴細胞DNA造成不可修復的損傷,從而抑制HSP70的表達,這和文獻報道[11-12]的生物體在接觸一般毒物應激時HSP70表達水平與DNA損傷有較強的負相關性.總之,本實驗結果表明B(a)P高劑量時不僅對細胞活力產生抑制作用,同時也通過影響細胞因子的分泌,從而影響免疫細胞的正常生理功能,導致機體免疫功能紊亂,促進腫瘤的發生,并且通過影響機體應激系統,促進腫瘤的發生.但是B(a)P如何通過影響免疫細胞的應激系統,可能導致細胞因子分泌變化的機制有待研究,從而為進一步闡明B(a)P對機體免疫損傷提供依據.

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