桑腸桿菌VL4-3轉化阿魏酸生產香蘭素

喻林,魏敏,陳義坤,羅誠浩,宋旭艷,王潔,陳勇

(1.湖北大學中藥生物技術省重點實驗室,湖北 武漢 430062；2.湖北中煙工業有限責任公司技術中心,湖北 武漢 430040)

香蘭素(Vanillin)又名香草醛,化學名為3-甲氧基-4-羥基苯甲醛.是一種以奶油香草為特征的風味物質,廣泛用于冰淇淋、巧克力、乳制甜點、奶油糖果、焙烤食品、豆奶、可樂飲料和煙酒等食品制造中[1].香蘭素年用量很大,多數為化學合成[2],其中以愈創木酚和木質素為原料合成的香蘭素為主[3].天然香蘭素主要是從香莢蘭豆莢中提取,由于香莢蘭植物的種植受地域和氣候環境的限制,產量極少,遠遠不能滿足市場的需求[4].但是大多數化學合成的香蘭素在純度、香氣、安全性等方面都亞于天然提取的香蘭素,并且化學工藝產生的廢棄物對環境存在很大危害.近年來,美國和歐洲的法律認可采用生物活細胞或其中的組成部分所生產的物質為天然產物[5].因此,利用微生物轉化法生產天然香蘭素成為目前的研究熱點[6].本實驗室從香莢蘭莖中篩選得到的一株桑腸桿菌VL4-3,并首次發現其能轉化阿魏酸生產香蘭素,對其發酵轉化阿魏酸生產香蘭素的發酵工藝進行了研究.

1 材料與方法

1.1菌種與培養基桑腸桿菌VL4-3：從香莢蘭植物的莖中篩選得到,并經過生理生化分析、16SrDNA擴增和序列分析鑒定為桑腸桿菌(Enterobactermori).斜面培養基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基)：馬鈴薯浸液200 mL/L,葡萄糖20 g/L,瓊脂13 g/L.原始種子培養基(牛肉膏蛋白胨培養基)：牛肉膏5 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化鈉5 g/L.發酵原始培養基(高氏一號培養基)：可溶性淀粉20 g/L,KNO31 g/L,NaCl 0.5 g/L,K2HPO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L.麥芽糖蛋白胨培養基：麥芽糖50 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化鈉5 g/L.

1.2試劑與儀器試劑：甲醇(色譜純)；冰乙酸(分析純)；香蘭素(Sigma-Aldrich 公司,99.99%)；阿魏酸(陜西森弗生物技術有限公司,98%)及其儲備液(稱取一定量的阿魏酸,在熱水中加熱至完全溶解,用1 mol/L的氫氧化鈉調pH到7.0,定容到30 g/L,然后用過濾法滅菌,4 ℃避光保存).香蘭素(Sigma-Aldrich 公司,99.99%). 儀器：Aglient 1100 高效液相色譜儀,柜式恒溫搖床(武漢中科科儀技術發展有限公司,HQL 300 B),無菌操作臺(蘇凈集團安泰公司,SW-CJ-1FD).

1.3培養方法初始種子液培養方法：用接種環挑取一環L4-3到裝有200 mL液體種子培養基的500 mL三角瓶中,30 ℃,150 r/min培養24 h.

初始發酵方法：將L4-3菌種以10%(V/V)的接種量接入到發酵培養基中,30 ℃,150 r/min培養24 h,加入2.7 g/L的阿魏酸,30 ℃,150 r/min培養12 d.

1.4樣品含量測定方法取一定量的發酵液,按1∶4的比例加入甲醇,震蕩30 min,11 000 r/min離心5 min取上清,0.22 μm濾膜過濾(過濾時棄掉首先濾出的3 mL).經上述處理的發酵液用高效液相色譜檢測香蘭素含量,色譜條件為：Agilent Eclipse XDB-C8色譜柱 (5 μm,4.6 mm*150 mm),甲醇/0.5%冰乙酸(30/70,V/V)流動相,流速 1 mL/min,檢測波長280 nm,進樣量 10 μL,檢測時間 40 min.用50%甲醇溶液配制1 g/L的標準樣品溶液,稀釋成一系列不同濃度,每次進樣10 μL,以峰面積對標準樣品濃度作圖,繪制標準曲線.香蘭素濃度和摩爾轉化率計算方法為：C香蘭素=(A香蘭素峰面積-23.948)/40.989；摩爾轉化率/%=(n香蘭素/n阿魏酸)×100.

2 結果及分析

2.1 發酵培養基對香蘭素產量的影響

2.1.1 碳源對香蘭素產量的影響 以高氏一號培養基為基礎培養基,固定氮源和無機鹽,分別以淀粉、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麥芽糖、麥芽浸粉、麩皮和谷殼作為碳源,濃度均為20 g/L,考察不同碳源對香蘭素產量的影響.由圖1可知,不同碳源對香蘭素產量影響由高到低依次是谷殼、麩皮、蔗糖、淀粉、麥芽浸粉、麥芽糖、葡萄糖和果糖.實驗結果表明緩效碳源(麩皮和谷殼)比速效碳源更易于桑腸桿菌VL4-3將阿魏酸轉化為香蘭素,這可能是由于緩效碳源中含有微生物生長所必需的生長因子(硫胺素、核黃素、尼克酸等)、多糖(戊聚糖)等[7-8],故選擇麩皮作為桑腸桿菌VL4-3產香蘭素的最佳碳源.

2.1.2 氮源對香蘭素產量的影響 以高氏一號培養基為基礎培養基,固定碳源和無機鹽,分別以酵母粉、黃豆餅粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、動物蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨和豆粕作為氮源,濃度均為1 g/L,考察不同氮源對香蘭素產量的影響.由圖2可知,不同氮源對香蘭素產量的影響由高到低依次是豆粕、黃豆餅粉、牛肉膏、動物蛋白胨、酵母粉、大豆蛋白胨、硝酸鉀、硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨.實驗結果表明以豆粕、硝酸銨、牛肉膏、酵母粉和硝酸鉀為氮源時香蘭素產量較高,但考慮到生產成本和產物香蘭素的天然性,選擇豆粕作為桑腸桿菌VL4-3產香蘭素的最佳氮源.

圖2 不同氮源對香蘭素產量的影響

圖3 不同無機鹽離子對香蘭素產量的影響

2.1.3 無機鹽離子對香蘭素產量的影響 以高氏一號培養基為基礎,固定碳源和氮源,分別以 Na2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、K2HPO4、CaCl2作為無機鹽,濃度均為0.5 g/L,考察不同無機鹽對香蘭素的影響.由圖3可知,磷酸氫鹽不利于菌種轉化阿魏酸生成香蘭素,而硫酸鹽利于香蘭素的產生,其中以FeSO4·7H2O為無機鹽時香蘭素的產量最高,故選擇FeSO4·7H2O作為桑腸桿菌VL4-3轉化阿魏酸生產香蘭素的最佳無機鹽.

2.1.4 最佳碳源氮源和無機鹽相對含量的確定-正交試驗 選取L9(34)正交表,對影響香蘭素產量的碳源(麩皮)、氮源(豆粕)和無機鹽(硫酸亞鐵)的添加量進一步做正交試驗,其因素和水平見表1,分析結果見表2.由表2的方差分析可見,3個因素對香蘭素產量的影響順序為硫酸亞鐵>麩皮>豆粕,即硫酸亞鐵的用量對香蘭素產量影響最大,豆粕用量對香蘭素產量影響最小.根據表2的結果可知最佳組合為麩皮10 g/L,豆粕1 g/L,硫酸亞鐵0.5 g/L.

表1 正交設計因素和水平表

表2 正交設計實驗表及結果

2.2 發酵培養條件對香蘭素產量的影響

2.2.1 發酵培養基初始pH值對香蘭素產量的影響 使用優化后的培養基,考察培養基的不同初始pH值對香蘭素產量的影響.由圖4可以看出,初始培養基pH在3～5時香蘭素的產量較低,初始培養基pH在6～10時香蘭素的產量相對較高,說明初始培養基在中性及偏堿性條件下更有利于桑腸桿菌VL4-3將阿魏酸轉化為香蘭素,且當pH值為8時香蘭素的濃度最高,故選用pH 8作為發酵培養基的最佳pH值.

圖4 發酵培養基初始pH值對香蘭素產量的影響

圖5 發酵溫度對香蘭素產量的影響

2.2.2 發酵溫度對香蘭素產量的影響 使用優化的培養基(pH=8.0),考察不同發酵溫度對香蘭素產量的影響.由圖5可以看出,當溫度在30～37 ℃之間時,香蘭素的產量逐漸升高；當溫度在37～40 ℃時,香蘭素的產量顯著降低.且當溫度在37 ℃時,發酵液中的香蘭素濃度最高,故以37 ℃作為菌種轉化阿魏酸生產香蘭素的最佳發酵溫度.

2.2.3 接種量、阿魏酸添加量和阿魏酸添加時間對香蘭素產量的影響 在上述優化的培養條件下,選取L9(34)正交表,考察菌種接種量、底物添加量和底物添加時間對香蘭素產量的影響.試驗因素和水平設計見表3,試驗結果方差分析見表4.結果表明,3個因素對香蘭素產量的影響順序為阿魏酸加入量>阿魏酸加入時間>菌種接種量,三因素最佳組合為菌種接種量為10%,底物添加量為8.5 g/L,底物添加時間為24 h.

表3 正交設計因素和水平表

表4 正交設計實驗表和結果分析

2.2.4 搖瓶裝液量和轉速對香蘭素產量的影響 轉速和搖瓶裝液量是影響溶氧及氧化還原反應的兩個重要因素.在上述優化的實驗條件和固定轉速(100 r/min)情況下,考察了裝液量對香蘭素產量的影響.由圖6可以看出,當裝液量大于容器容積10%時,發酵液中香蘭素的濃度均明顯降低,故實驗選用10%的裝液量(500 mL三角瓶中加入50 mL發酵培養基).在上述優化的實驗條件下和固定裝液量(容器容積的10%)情況下,考察搖床轉速對香蘭素產量的影響.由圖7可以看出,隨著轉速的增加,香蘭素的產量降低,當發酵轉速為100 r/min時,發酵液中香蘭素的濃度最高,故實驗選用100 r/min為發酵轉速.

2.2.5 發酵過程光照/避光對香蘭素產量的影響 由于香蘭素和阿魏酸在光照條件下易分解,因此我們考察光照發酵和避光發酵對香蘭素產量的影響.由圖8可以看出,在避光發酵條件下香蘭素的產量更高,因此桑腸桿菌VL4-3轉化阿魏酸生產香蘭素更適合在避光條件下進行.

2.3 種子培養基和培養條件的優化

2.3.1 種子液的培養溫度對香蘭素產量的影響 以上述優化的發酵培養基與發酵培養條件下,考察種子培養溫度對香蘭素產量的影響,結果見圖9.隨著種子液的培養溫度增加,香蘭素產量逐漸降低,故實驗選用25 ℃作為種子培養的最佳溫度.

圖6 搖瓶裝液量對香蘭素產量的影響

圖7 發酵轉速對香蘭素產量的影響

圖8 光照條件對香蘭素產量的影響

圖9 種子培養溫度對香蘭素產量的影響

2.3.2 種子培養基對香蘭素產量的影響 考察高氏一號培養基、牛肉膏蛋白胨培養基、麥芽糖蛋白胨培養基作為種子培養基對香蘭素產量的影響,結果見圖10.由于高氏一號培養基的營養貧乏,種子液中的菌種繁殖較慢,導致接種到發酵培養基中的菌種量少,因而得到的香蘭素濃度較低.牛肉膏蛋白胨培養基和麥芽糖蛋白胨培養基中營養充足,但后者相對前者發酵液中香蘭素濃度更高,因此選擇麥芽糖蛋白胨培養基作為該菌種轉化阿魏酸生產香蘭素的種子培養基.

2.3.3 種子液的轉速對香蘭素產量的影響 種子液培養轉速能影響菌種的數量,因此考察種子液培養轉速分別為100、150、200 r/min時對香蘭素產量的影響,結果見圖11.在100 r/min時香蘭素的產量最高,150 r/min時香蘭素的產量最低,故選擇100 r/min作為種子培養基的培養轉速.

圖10 種子培養基對香蘭素產量的影響

圖11 種子液培養轉速對香蘭素產量的影響

圖12 底物加入量對香蘭素產量的影響

2.4底物最大加入量由于阿魏酸對菌種有一定的毒性,因此菌種對阿魏酸的耐受程度直接影響發酵液中香蘭素的濃度.在接種24 h后,我們分別考察底物加入量對香蘭素產量的影響.圖12是不同底物添加量培養12 d時香蘭素的含量測定結果.當阿魏酸加入量在5.00 ～10.00 g/L之間,香蘭素產量升高,當阿魏酸加入量在10.00～13.33 g/L之間時,香蘭素的產量呈遞減趨勢.因此選用10 g/L的阿魏酸作為該菌種的最大耐受量.

2.5優化結果的驗證經優化得到VL4-3轉化阿魏酸生成香蘭素的最佳發酵條件如下.

液體發酵的最佳培養基：麩皮10 g/L,豆粕1 g/L,氯化鈉0.5 g/L,硫酸亞鐵0.5 g/L,pH=8；最佳發酵培養條件：接種量10%,搖瓶裝液量 10%,阿魏酸最大加入量 10 g/L,37 ℃,100 r/min,避光培養12 d；最佳種子培養基：牛肉膏蛋白胨培養基；最佳種子培養條件：25 ℃,100 r/min,24 h.

用以上的優化條件,進行了3次重復發酵實驗,得到香蘭素的濃度為2 262.43 mg/L,轉化率達到28.87%.比優化前香蘭素濃度(29.6 mg/L)提高了76.43倍,轉化率提高了11.4倍.

3 結論

通過單因素實驗和正交試驗優化后,桑腸桿菌VL4-3將阿魏酸轉化為香蘭素的發酵培養基組成為麩皮10 g/L,豆粕1 g/L,氯化鈉0.5 g/L,硫酸亞鐵0.5 g/L,pH=8.0；種子液培養基組成為麥芽糖50 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化鈉5 g/L.種子液的培養條件為25 ℃、100 r/min轉速培養24 h.在容器裝液量為10%的發酵培養基中接種10%的VL4-3種子液,培養24 h,加入10 g/L的阿魏酸,37 ℃、100 r/min轉速避光培養12 d,發酵液中香蘭素的濃度達到2 262.43 mg/L,轉化率達到28.87%.

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