基質金屬蛋白酶1及其抑制劑在舌癌浸潤性轉移中的作用

張 鵬 紀 亮 沈 雷 李靜平 王 巖 張翠香 沙 峰

齊齊哈爾醫學院解剖教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006

基質金屬蛋白酶1及其抑制劑在舌癌浸潤性轉移中的作用

張 鵬 紀 亮 沈 雷 李靜平 王 巖 張翠香 沙 峰

齊齊哈爾醫學院解剖教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006

目的 檢測舌癌黏膜固有層組織中基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）、基質金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）的表達，揭示它們在舌癌浸潤和轉移中的作用。方法應用ABC免疫組織化學染色方法分別檢測舌癌標本及正常組織各取材部位中MMP-1、TIMP-1的免疫學定位及表達情況。結果 舌癌組織的MMP-1和TIMP-1的陽性表達率與對照組相比，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；舌癌組織中的MMP-1和TIMP-1的表達與舌癌大小無關（P＞0.05），而與舌癌分化程度、有無轉移、病理分級等具有差異（P＜0.05或P＜0.01）。 結論 MMP-1和TIMP-1在舌癌黏膜固有層組織中的表達關系，有助于判斷舌癌的侵襲和轉移及病理分期。

基質金屬蛋白酶-1；基質金屬蛋白酶抑制劑-1；舌癌

基質金屬蛋白-1（matrix metalloproteinases，MMP-1）屬于膠原酶，可降解細胞外基質（extracellular matrix，ECM）中的膠原纖維成分?；|金屬蛋白酶抑制劑-1（Tissue Inhibitor of Metalloproteinases，TIMP-1）對 MMP-1活性有抑制作用，二者之間的平衡可維持ECM中膠原纖維合成和分解的穩定，并與腫瘤的發生、浸潤和轉移密切相關[1]。腫瘤的浸襲和轉移機制研究已經成為熱點，目前，對于舌癌如何突破ECM造成浸潤轉移尚無定論。本實驗對舌癌的MMP-1、TIMP-1的表達及關系進行研究，以解決舌癌浸潤轉移的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗組選擇本課題組2006～2008年使用二甲基苯并蒽（DMBA）涂抹金黃地鼠舌體建立的舌癌模型存檔標本，其中涂抹 4、8、12、16、20、24 周各為一組，每組 5例，共計 30例；將上述標本切片行HE染色，在顯微鏡下觀察。確定原位癌11例，進展期舌癌19例（包括浸潤癌13例，轉移癌6例）；有淋巴結轉移者17例，無淋巴結轉移者13例。每例均按癌巢大小取取癌中組織（腫瘤中心區）、癌周組織（腫瘤邊緣區）；對照組取上述組織塊中的正常組織各1塊，共計30例。

1.2 試劑

兔抗人MMP-1、TIMP-1多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；SP超敏試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司；DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

HE染色法，光鏡下觀察切片，確定組織的病理分級：原位癌、浸潤癌、轉移癌。應用ABC免疫組織化學染色方法分別檢測舌癌標本各取材部位中MMP-1、TIMP-1的定位及表達情況。

1.4 結果判斷

MMP-1、TIMP-1均采用半定量積分法：以胞質內出現黃色顆粒狀物質為陽性，根據腫瘤細胞胞漿染色的程度及染色細胞百分率進行評分：基本不著色者為0分；著色淡黃色為1分；棕色為2分；深棕色為3分。著色細胞占計數細胞百分率：≤5%為 0分；6%～25%為 1分；26%～50%為 2分；≥51%為3分。將每張切片著色程度得分與著色細胞百分率得分相乘，為 MMP-1、TIMP-1 表達強度積分。≤1 分為陰性（-）；2～3分為弱陽性（+）；4～5 分為中等陽性（++）；≥6 分以上為強陽性（+++）。免疫組化ABC法進行結果判斷，用已知陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗作空白對照，以正常血清代替一抗作陰性對照。

1.5 圖像分析

采用image-pro plus全自動圖像分析系統，觀察、檢測以上2種染色切片，在200倍放大下隨機選取5個測定域，分別測定MMP-1和TIMMP-1表達的數密度（目標數/統計場面積）[2]。

1.6 統計學方法

所得數據采用SPSS 13.0軟件進行統計分析,計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，等級資料采用秩和檢驗。計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MMP-1和TIMP-1蛋白在舌癌黏膜固有層中的表達

MMP-1在舌癌黏膜固有層的陽性表達率為90.0%（27/30），其中（+++）表達為 43.3%（13/30），（++）表達為 26.67%（8/30），（+）表達為20.0%（6/30），其陽性表達主要位于細胞漿內。TIMP-1在舌癌黏膜固有層的陽性表達率為86.7%（26/30），其中（+++）表達為 33.3%（10/30），（++）表達為 26.7%（8/30），（+）表達為26.67%（8/30），其陽性表達主要位于細胞漿內。MMP-1和TIMMP-1蛋白在實驗組中的表達與對照組（陽性率分別為10.0%和13.33%）相比，差異有高度統計學意義（P<0.01）。在癌中、癌周組織中MMP-1和TIMP-1蛋白的表達比較，差異均有高度統計學意義（均P<0.01）），見表1。

表1 舌癌黏膜固有層各部位中MMP-1、TIMP-1的強度積分表達（±s，分）（n=30）

表1 舌癌黏膜固有層各部位中MMP-1、TIMP-1的強度積分表達（±s，分）（n=30）

指標 MMP-1癌中組織 癌周組織TIMP-1癌中組織 癌周組織-++++++0.45±0.15 2.21±0.86 4.46±0.58 24.83±0.59 0.49±0.57 2.72±1.86 5.94±1.59 32.59±1.50 0.73±1.34 3.54±0.68 5.97±3.43 21.48±1.35 0.57±1.45 2.52±1.83 5.85±2.47 18.47±1.15

2.2 MMP-1和TIMMP-1蛋白表達的關系

隨著周齡的增加，舌癌標本組織中的MMP-1和TIMP-1的表達均增強，二者與舌癌大小無關（P＞0.05），而與舌癌分化程度、有無轉移等差異有高度統計學意義 （P<0.05或P<0.01），見表2。

3 討論

在生理情況下，細胞外基質（ECM）在維持正常組織結構與功能及細胞生長、分化過程中起到非常重要的作用。大量研究表明，它不再被認為是靜止不動的，而是處在不斷代謝更新、降解重塑的動態平衡中。近來在研究有關ECM合成和降解的代謝平衡調節中，引人注目的是MMPs和TIMPs兩個酶系統的作用。ECM的主要成分由膠原纖維和彈性纖維構成，MMP-1在這一過程中起著分解膠原纖維的作用。TIMP-1除了是MMP-1的天然抑制劑外，還對所有類型MMPs均有抑制作用。在生理情況下，它可參與細胞外基質的改建及影響細胞生長[3]。本實驗對照組的MMP-1、TIMMP-1含量差異無統計學意義（P＞0.05），亦證明了二者同時存在于細胞的生理情況下，可參與細胞外基質的改建及影響細胞生長。

表2 舌癌黏膜固有層病理特征與MMP-1、TIMMP-1蛋白表達的關系

MMPs和TIMPs與腫瘤的發生、發展密切相關：大部分腫瘤中均可檢測到MMPs和TIMPs的表達異常。有研究表明，在頭頸部鱗癌中，腫瘤細胞可通過分泌MMPs降解細胞外基質，促進腫瘤的侵襲轉移并影響患者的轉歸和預后[4]。本研究從表1中可發現MMP-1隨著舌癌的進展，其癌中心區域高表達性愈來愈高（P<0.01），說明舌癌發生轉移的趨勢越來越高；當 MMP-1 表達為（++）～（+++）時，癌周圍區組織的MMP-1表達比癌中心區表達要高，這是由于隨著舌癌的進展，癌體積逐漸變大，癌中心區域會產生缺血性改變，中心區細胞缺血，減少分泌MMP-1的同時，還會分泌缺氧誘導因子（HIF-1）等細胞因子，誘導新生血管形成[5]，而新生血管的發生必須侵及基底層到達癌體，此時癌周圍區域受到缺血、細胞因子等因素刺激會使MMP-1分泌就會迅速升高，以溶解膠原纖維，促使新生血管的形成[6]。MMP-1增多的同時，TIMP-1也會相應增多，這是機體的應答機制，原位雜交也發現MMP的mRNA主要分布在腫瘤邊緣的間質細胞中，或同時分布在瘤細胞和間質中[7]，造成這種不同分布的機制可能就是由于腫瘤血管生成的需要，也說明MMP-1具有促血管生成的作用。但是從表1來看，雖然MMP-1和TIMP-1皆升高，但是后者的升高的程度較小。這主要是由于MMP家族有激活的級聯效應[8]，導致20周以后MMP-1表達明顯升高。通過表2可以發現MMP-1和TIMP-1的表達與腫瘤大小無關（P＞0.05），但與腫瘤的淋巴結轉移、分化程度等具有密切聯系 （P<0.01），這是由于MMP-1參與破壞基底層的膠原纖維，以利于舌癌的轉移，這與低分化細胞分泌高表達的MMP-1觀點相一致[9]。Gunduz等[10]通過研究口腔纖維化，發現TIMP-1在纖維化的病損比正常高，可能MMP-1會使細胞外基質的合成和堆積增加，高表達的TIMP-1對MMP-1的抑制作用，從而破壞MMPs與TIMP的動態平衡，TIMP-1在口腔黏膜下纖維化的成纖維細胞中表達，隨著口腔黏膜纖維化的嚴重程度加大而增加，因此TIMP-1可能與口腔黏膜纖維化的病理過程有關[11]。MMP-1和TIMP-1在舌癌的發生、發展過程中所起的作用不僅是通過降解細胞外基質和基底膜，促進腫瘤侵襲轉移的，而且還可以促進腫瘤組織中新生血管的形成，增強了腫瘤侵襲能力和轉移能力，抑制MMP-1具有抑制腫瘤侵襲轉移和血管生成的雙重作用。

綜上所述，MMP-1和TIMP-1在舌癌黏膜固有層組織中的表達與舌癌進展密切相關，與舌癌分化程度、有無轉移、病理分級等關系密切，可作為判斷舌癌的侵襲和轉移及病理分期的參考?？梢灶A見，基質金屬蛋白酶及其抑制劑在抗腫瘤轉移的治療中，將具有良好的應用前景。

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Effect of MMP-1 and TIMP-1 in tongue cancer with invasion and metastasis

ZHANG Peng JI Liang SHEN LeiLI Jingping WANG Yan ZHANG Cuixiang SHA Feng Department of Anatomy,Qiqihar Medical University,Heilongjiang Province,Qigihar 161006,China

ObjectiveTo detect the expression of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1),tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1(TIMP-1)in mucosa lamina propria tissue of tongue cancer,in order to reveal the role of MMP-1 and TIMP-1 in the invasion and metastasis of tongue cancer.MethodsThe immunological localization and expression of MMP-1 and TIMP-1 in tongue cancer specimens and normal tissues were detected by immunohistochemical staining methods(ABC method).ResultsPositive expression rate of MMP-1 and TIMP-1 between tongue cancer tissues and normal tissues was significantly different(P＜0.01).The expression of TIMP-1 and MMP-1 in tongue cancer tissues had no relationship with the size of tongue cancer(P＞0.05),but it had significantly differences compared with differentiation degree,metastasis and pathological grade of tongue cancer(P＜0.05 or P＜0.01).ConclusionThe expression of MMP-1 and TIMP-1 in mucosa lamina propria tissue of tongue cancer can contribute to judge the invasion,metastasis and pathological grade of tongue cancer.

Matrix metalloproteinase-1;Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1;Tongue cancer

R735.3

A

1673-7210（2012）08（c）-0014-03

黑龍江省齊齊哈爾市科學技術計劃項目（項目名稱：細胞外基質在鼠舌癌侵襲和轉移中的實驗性研究）；黑龍江省教育廳科學技術研究面上項目 （No：12521635）； 黑龍江省 自 然 科 學 基 金課 題項 目 （No：D200957）；黑龍江省齊齊哈爾市科學技術計劃項目（項目名稱：Tenascin-C、MMP-1及其抑制因子對人增生性瘢痕作用的分子機制；No：SHFZD9011）。

2011-12-18 本文編輯：谷俊英）