兒童過敏性紫癜急性期Th17細胞功能和CD4＋CD25＋調節性T細胞水平變化

劉萍，張秋業

（1 青島市李滄區中心醫院兒科，山東 青島 266041； 2 青島大學醫學院附屬醫院兒科）

過敏性紫癜（HSP）是兒童時期最常見的一種自身免疫性血管炎性疾病，臨床癥狀表現為紫癜樣皮膚損害以及胃腸道、腎臟、關節等多個系統的損害。HSP急性期有明顯免疫功能失調，表現為外周血T淋巴細胞亞群功能紊亂，B淋巴細胞呈多克隆活化，抗體分泌增多及相關細胞因子的改變。HSP病因及發病機制十分復雜，其免疫失衡機制尚未闡明。Th17細胞是最近發現的一種以分泌白細胞介素17（IL－17）為主的效應性T細胞，在自身免疫和促炎癥反應方面具有重要作用。CD4＋CD25＋調節性T細胞（CD4＋CD25＋Treg）是一群重要的具有免疫調節和免疫抑制雙重作用的CD4＋T細胞，它對效應性T細胞有抑制作用，是機體維持自身免疫耐受的重要組成部分。業已證實，Th17細胞增加和（或）CD4＋CD25＋Treg降低與炎癥和各種自身免疫性疾病發病密切相關。本文觀察了54例HSP病兒急性期外周血IL－17和CD4＋CD25＋Treg細胞水平變化，以及其與淋巴細胞亞群之間的相關性，以期探討Th17和CD4＋CD25＋Treg水平變化在兒童 HSP發病機制中的作用。

1 資料和方法

1.1 對象及分組

1.1.1 HSP組 2009年10月—2010年12月，選取青島大學醫學院附屬醫院兒科診治的HSP急性發作期病兒54例，男34例，女20例；年齡3～13歲，平均7.5歲。均符合1990年美國風濕病協會制定的診斷標準［1］。根據是否有血尿或（和）蛋白尿分為腎炎組（HSPN組）23例和非腎炎組（NHSPN組）31例。近期未使用免疫抑制性藥物。

1.1.2 對照組 為同期青島大學醫學院附屬醫院兒童保健門診健康查體兒童30例，男18例，女12例；年齡2～13歲，平均7.2歲。其中20例應用流式細胞術檢測CD4＋CD25＋Treg亞群，男18例，女2例；年齡2～11歲，平均年齡5.1歲。既往均無過敏性疾病史，采血前4周內無感染及用藥史。

1.2 檢測指標及方法

1.2.1 標本采集 清晨6：00－7：00時取空腹肘靜脈血2 mL，即刻加入無菌肝素管（肝素20 k U／L）充分抗凝，分裝入兩支試管，一支試管即刻送檢；另一試管以1 200 r／min離心10 min，收集血漿，－30℃冰箱保存。

1.2.2 血漿IL－17水平測定 采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法，按試劑盒說明書操作。試劑盒購自上海迪奧生物制品公司（R＆D分裝）。

1.2.3 CD4＋CD25＋Treg和淋巴細胞亞群的檢測采用流式細胞術，試劑購自美國Beck man－Coulter公司。

1.3 統計學處理

應用SPSS 17.0及PPMS 1.5［2］統計學軟件進行數據處理，結果以±s表示，數據間比較采用t檢驗，兩變量間相關性采用直線相關分析法。

2 結 果

2.1 HSP病兒血漿IL－17水平變化

HSP組血漿IL－17水平為（86.65±13.90）ng／L，對照組為（29.75±21.65）ng／L，兩組比較差異有極顯著意義（t＝14.66，P＜0.01）。HSPN 組與NHSPN組血漿IL－17水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組血漿IL－17和CD4＋CD25＋Treg水平比較（±s）

表1 各組血漿IL－17和CD4＋CD25＋Treg水平比較（±s）

組 別 n IL－17（ρ／ng·L－1）CD4＋CD25＋Treg（χ／%）對 照 組 30 29.75±21.65 3.93±0.42 NHSPN組 31 89.48±11.22 2.22±1.09 HSPN組23 82.45±16.28 2.29±0.95

2.2 HSP病兒外周血CD4＋CD25＋Treg水平變化

HSP組病兒外周血CD4＋CD25＋Treg水平為（2.25±1.02）%，較對照組（3.93±0.42）%明顯降低（t＝7.28，P＜0.01）。HSPN組與NHSPN組外周血CD4＋CD25＋Treg水平相比較，差異無顯著意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 HSP病兒淋巴細胞亞群水平變化

與對照組比較，HSP組外周血CD4＋細胞比例明顯降低，CD19＋細胞比例升高，差異有統計學意義（t＝4.363、7.370，P＜0.05）；CD3＋、CD8＋、CD3－CD56＋和CD3＋HLADR＋比例均無明顯改變（t＝－1.30～1.98，P均＞0.05）。HSP組CD4＋CD25＋Treg的水平與CD4＋細胞呈正相關（r＝0.554，P＜0.01），而與CD19＋細胞呈負相關（r＝－0.305，P＜0.05）。而CD4＋CD25＋Treg水平與CD8＋細胞、CD3＋細胞、CD3－CD56＋細胞和CD3＋HLADR＋細胞則無相關性（r＝－0.109～0.287，P＞0.05）。見表2。

表2 HSP病兒外周血T細胞亞群檢測（χ／%，±s）

表2 HSP病兒外周血T細胞亞群檢測（χ／%，±s）

組別 n CD3＋ CD4＋ CD8＋對照組 20 61.80±7.24 30.94±7.53 25.85±5.17 HSP組 54 53.72±8.54 23.98±7.73 25.13±6.08組別 n CD3－CD56＋ CD19＋ CD3＋HLADR＋對照組 20 14.05±10.89 20.37±5.80 1.09±0.75 HSP組54 9.74± 5.92 33.81±9.42 3.10±1.95

2.4 HSP病兒血漿IL－17水平與CD4＋CD25＋Treg水平相關性

HSP病兒血漿IL－17水平與CD4＋CD25＋Treg細胞水平呈明顯負相關（r＝－0.295，P＜0.05）。

3 討 論

HSP是以小血管炎為主要病變的系統性血管炎，是兒童期最常見的免疫性血管炎，可出現紫癜樣皮膚損害以及胃腸道、腎臟、關節等多個系統的損害。迄今為止，該病的病因及發病機制仍未完全闡明。前期大量研究結果表明，HSP病兒存在Th1／Th2亞群功能失調，尤其是Th2亞群功能亢進，表明HSP急性期存在免疫功能紊亂［3］。

Th17細胞是一種不同于Th1、Th2的CD4＋T細胞亞群，其分泌的最重要的效應因子是IL－17。IL－17與受體結合后，通過活化絲裂原活化的蛋白激酶和NF－k B發揮其生物學效應，并上調IL－1β、TNF－α、IFN－γ等炎癥細胞因子的基因表達，促進機體炎癥進展。Th17細胞還可分泌IL－6及TNF－α等以動員、募集和分化中性粒細胞，介導促炎癥反應，在感染性疾病和自身免疫性疾病的病理過程中發揮重要作用。近期大量文獻報道，冠心病、過敏性疾病和自身免疫性疾病如類風濕性關節炎病人IL－17表達增加［4－6］。本實驗結果顯示，HSP病兒血漿IL－17水平明顯增高，與對照組比較差異有顯著性，與文獻［5］結果相符，說明異常增高的IL－17參與了HSP的發病，在HSP的病理過程中起到重要作用。本文結果還顯示，HSPN組與NHSPN組血漿IL－17水平差異無顯著性，提示急性期有無腎臟損害的HSP病兒外周血IL－17水平變化并無差異。

研究認為，HSP存在的T細胞功能紊亂不僅僅局限于Th2優勢明顯，調節性T細胞數量減少導致免疫抑制效應不足也可能是導致HSP免疫失衡的重要原因。Treg細胞是一群重要的同時具有免疫調節和免疫抑制雙重作用的CD4＋T細胞，其參與了維持外周耐受及抑制自身免疫。Treg細胞既可通過細胞間直接接觸、分泌抑制性細胞因子如IL－10、TGF－β等發揮抑制效應，還可下調抗原呈遞細胞（APC）上CD80和CD86的表達來影響其抗原呈遞能力，并誘導APC分解色氨酸，降低效應性T細胞活性，從而發揮抑制作用。由此可見，Treg細胞對機體免疫應答起著調節與抑制雙重作用，使機體免疫系統既清除異物抗原，又不致損傷機體。本研究結果顯示，HSP病兒CD4＋CD25＋Treg細胞水平較對照組顯著降低，與文獻［7］結果一致。HSP病兒CD4＋CD25＋Treg細胞與CD4＋細胞呈正相關，而與CD19＋細胞呈負相關，提示CD4＋CD25＋Treg細胞異常與HSP發病機制中免疫功能紊亂有密切的關系，表明HSP急性期存在Treg細胞免疫調節及對機體的免疫抑制功能不足，從而引發免疫紊亂。

近年來，Th17／Treg的平衡在維持免疫系統穩態中的作用越來越受到重視。Th17細胞和Treg細胞分別對自體免疫和炎癥反應起正向和負向調控作用，同時兩種細胞的分化也是互為逆反的過程。RORγt及Foxp3分別是Th17及Treg的特異性轉錄因子。當機體處于穩定狀態下或無炎癥損傷時，免疫系統產生的TGF－β濃度較高，可上調Foxp3的表達，誘導Treg的產生，從而維持機體的免疫耐受；而當機體發生感染時，炎癥遞質IL－6則大量產生，協同低濃度的TGF－β誘導RORγt的產生，從而促進Th17細胞的分化，介導前炎癥反應［8］。由此可見，Th17／Treg平衡維持機體免疫平衡，一旦受感染、遺傳體質影響，兩者的平衡打破，便可引起機體全身或局部的免疫異常反應。既往研究已經證實，Th17增加和（或）Treg降低在大量的炎癥和自身免疫性疾病如動脈粥樣硬化、腎臟移植排斥等反應中發揮重要的作用［9－10］。本文的研究結果顯示，兒童HSP急性期血漿IL－17水平顯著增高，同時伴有CD4＋CD25＋Treg細胞明顯降低，且兩者呈明顯負相關，表明在HSP急性期Th17細胞功能增強而CD4＋CD25＋Treg細胞免疫抑制效應不足，呈現Th17／Treg失衡狀態。Th17／Treg失衡是導致HSP免疫紊亂的重要原因，在HSP發病機制中具有重要作用。如何調整這種平衡或許會為HSP的免疫治療提供新思路，為臨床治療開辟新的途徑。

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