CR1基因多態性與漢族人遲發性阿爾茨海默病關系

田燕，盧瑞春，郁金泰，譚蘭

（青島市市立醫院神經內科，山東 青島 266071）

阿爾茨海默病（AD）是一種病因不明的進行性神經系統變性疾病，根據發病年齡（以65歲為界）分為早發性AD和遲發性AD（LOAD）。AD的發病與遺傳變異有關的觀點已經得到廣泛認可［1］。載脂蛋白E（Apo E）ε4等位基因是目前已經被證實的AD的獨立危險因素之一，但攜帶此等位基因的病人僅占38%［2］。因此，發現更多的遺傳基因標記均對診斷和治療AD是非常有必要的。淀粉樣β蛋白誘導補體系統激活在AD發病中發揮重要作用。補體受體1（CR1）被認為有助于清除淀粉樣β蛋白。最近有研究結果表明，CR1的基因多態性是否與高加索人的LOAD有關［3］。但是，CR1基因多態性與漢族人LOAD有關尚需研究證實。本研究旨在探討CR1基因多態性與LOAD發病的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

LOAD組254例為2006年9月—2010年10月我科的住院癡呆病人，其中男118例，女136例；平均年齡（78.4±6.7）歲；發病年齡為（72.6±6.8）歲。LOAD診斷均符合美國國立神經病、語言機能紊亂和卒中研究所及阿爾茨海默病和相關疾病協會（NINCDS－ADRDA）的標準。均排除了其他神經系統退行性疾病，無AD及精神病家族遺傳史。對照組357例為來自我院體檢門診的健康人，其中男161例，女196例；平均年齡（78.7±6.4）歲。均無記憶和智能障礙，MMSE評分＞28；臨床及實驗室檢查均正常；均無自身免疫疾病、糖尿病、心肌梗死、哮喘及腦卒中病史。兩組均為中國北方漢族人。此項研究獲得研究對象的同意及倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 基因提取 采集外周血5 mL，ACD抗凝，采用苯酚－氯仿法提取基因。

1.2.2 CR1基因多態性檢測 引物的設計和合成由上海生工公司完成。rs6656401引物序列：上游引物，5′－ACGTTGGATGGCTTGTAGATGCATCATTTCC－3′；下游引物，5′－ACGTTGGATGGACAGAAGAGCAAAGGACAC－3′；擴增引物，5′－ACACACAGAGGAGAAGGCGA－3′。rs3818361引物序列：上游引物，5′－ACGTTGGATGAAAGGACAGTTCCAGAGCAC－3′；下游引物，5′－ACGTTGGATGTTTTAAGCCCTCTGGTAAGC－3′；擴增引物，5′－CCTCTGGTAAGCATAAGATATA－3′。PCR參數為95℃15 min；95℃5 s、56℃20 s、72℃30 s，共50個循環；72℃30 s［4］。

1.2.3 Apo E基因型檢測 引物序列為：5′－ACAGAATTCGCCCCGGCCT GGTACAC－3′和5′－TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA－3′。PCR 參數為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、62 ℃ 30 s、70 ℃1 min，共30個循環；70℃5 min［5］。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離酶切產物，銀染后Gel－Doc 2000下照相分型。

1.3 統計學處理

用H WJ軟件進行Hardy－Weinberg平衡估計，其他統計分析用SPSS 11.5軟件完成。用直接計數法計算等位基因和等位基因型頻率，各組間基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗。

2 結 果

2.1 各基因組Hardy－Weinberg平衡吻合度檢測

除LOAD組rs6656401以外，對照組和LOAD組病人中其他SNP位點的基因型分布均符合Hardy－Weinber g平衡法則（P＞0.05）。

2.2 兩組臨床特征比較

LOAD組和對照組的年齡、性別無明顯差異（P＞0.05）。LOAD 組攜帶 Apo Eε4等位基因者120例，對照組攜帶Apo Eε4等位基因者84例，攜帶Apo Eε4等位基因可增加LOAD的發病風險（χ2＝5.52，P＜0.05，OR＝2.91，95%CI＝2.06～4.12）。

2.3 兩組rs6656401和Apo E等位基因和基因型頻率分布

LOAD組與對照組CR1基因rs6656401的基因型和等位基因頻率差異有顯著意義（χ2＝6.56、7.16，P＜0.05），等位基因A顯著增加了LOAD的發病風險（OR＝2.60，95%CI＝1.13～5.98）。這一顯著性差異在非Apo Eε4攜帶者中依然存在（χ2＝11.78、11.58，P＜0.05），而在 Apo Eε4攜帶者中則未發現兩組間rs6656401基因型和等位基因頻率差異有顯著性（P＞0.05）。見表1～3。

表1 兩組rs6656401等位基因和基因型頻率分布（例（χ／%））

表2 兩組ApoEε4攜帶者rs6656401等位基因和基因型頻率比較（例（χ／%））

表3 兩組非ApoEε4攜帶者rs6656401等位基因和基因型頻率比較（例（χ／%））

2.4 兩組CR1基因rs3818361基因型和等位基因頻率分布

LOAD組與對照組CR1基因rs3818361基因型和等位基因頻率差異無顯著性（P＞0.05）。然而，將該位點經是否攜帶Apo Eε4分層后，發現非Apo Eε4攜帶者中兩組等位基因頻率差異有顯著性（χ2＝4.45，P＜0.05，OR＝1.38，95%CI＝1.02～1.87）。見表4～6。

表4 兩組CR1基因rs3818361基因型和等位基因頻率比較（例（χ／%））

表5 兩組ApoEε4攜帶者CR1基因rs3818361基因型和等位基因頻率比較（例（χ／%））

表6 兩組非ApoEε4攜帶者CR1基因rs3818361基因型和等位基因頻率比較（例（χ／%））

2.5 LOAD多因素Logistic回歸分析

經過性別、年齡和Apo E調整以后，CR1基因rs6656401等位基因A攜帶者（基因型AA和AG）較基因型GG純合子導致LOAD的風險高2.40倍（OR＝2.40，95%CI＝1.00－5.73）。而rs3818361基因型TT和CT與CC間的差異則無顯著性（P＞0.05）。

2.6 對這兩個位點可能組合的單倍型分析

AT單倍型在LOAD組出現的頻率高于對照組（χ2＝4.70，P＜0.05，OR＝2.44，95%CI＝1.06～5.62）。見表7。

表7 兩組單倍型頻率比較（例（χ／%））

3 討 論

3.1 Apo E基因與LOAD

業已證實，Apo Eε4等位基因被認為是LOAD發病的易感基因［6］，本研究結果也證實了這一點。但是，Apo Eε4等位基因僅占LOAD發病獨立危險因素的40%～50%［7］。國內外的研究不僅證實此等位基因是LOAD的遺傳易感基因，而且證實其與其他一些遺傳易感基因存在相互作用［8］。目前，Apo Eε4等位基因已經成為LOAD遺傳研究的基本參量［9］。

3.2 CR1基因與LOAD

Aβ是一種異質的分子結構，能夠激活補體系統并與C3b結合。曾經有研究認為，β蛋白誘導補體激活是AD的重要發病機制［10］。已經有研究發現轉基因鼠過度表達C3能減少Aβ的沉積和病理作用［11］。相反，抑制C3轉化酶的表達則加速Aβ的沉積和神經退行性改變［12］。Aβ通過C3b介導與紅細胞表面的CR1相結合，并最終被紅細胞清除出循環系統。而CR1作為補體的調節劑主要存在于外周血細胞的細胞膜中。CR1還存在于外周神經有髓鞘纖維的施萬細胞內，并推測其通過限制補體激活而阻止有髓鞘纖維脫髓鞘改變［13］。有研究發現，可溶性的CR1具有治療自身免疫性疾病和炎癥性疾病的作用。因此，我們推測CR1在AD發病中具有保護作用。

雖然本研究中rs3818361和rs6656401位點均位于CR1的內含子中不能直接參與調整蛋白的表達，但是此內含子基因的突變可能通過影響CR1基因的表達而導致LOAD的發病。

最近 LA MBERT 等［3］的研究結果顯示，CR1的基因多態性是高加索人患AD的重要基因危險因素，rs6656401和rs3818361的等位基因是LOAD發病的危險因素，尤其是rs6656401。另外一項基因組研究顯示，rs3818361是歐洲和美洲人群發生AD的危險因素［14］。本研究結果顯示，rs6656401基因多態性與LOAD發病有關，rs6656401的A等位基因與G等位基因聯合能增加LOAD的發病風險，此結論與LA MBERT等的研究結論相一致。但本研究未顯示rs3818361的等位基因與LOAD發病有關。LOAD組與對照組CR1基因rs3818361基因型和等位基因頻率分布也沒有顯著性差異。用是否攜帶Apo Eε4分層后，發現非Apo Eε4攜帶者中LOAD組rs6656401的A等位基因和rs3818361的T等位基因出現的頻率較對照組高。這些情況均與LA MBERT等的研究結果不同，考慮可能與種族不同有關。本研究結果還表明，AT單倍型是LOAD發病的危險因素。

綜上所述，CR1基因突變可能通過影響Aβ的清除而導致LOAD發病，rs6656401的A等位基因是漢族人患LOAD的重要危險因素。

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