不同劑量的DEHP對子代大鼠學習記憶的影響

張晶瑩 宋昕恬 孟令儀

DEHP(鄰苯二甲酸二乙基己酯)屬于鄰苯二甲酯類化合物，是目前塑料工業中應用最廣泛的增塑劑之一，主要應用于各種塑料產品如纖維素樹脂、聚乙烯和聚氯乙烯食品包裝材料和醫用材料的生產加工。目前，鄰苯二甲酸酯在自然環境中分布的范圍非常廣，幾乎無處不在。調查發現，有13種物質在所有受測試者身上都被發現，含量最高的首推DEHP［1］，這種物質可能導致內分泌失調，影響生殖、妊娠和性功能。DEHP可以通過胎盤屏障進入胎兒體內聚集，也可直接作用于胎兒［2，3］。如果在孕期接觸DEHP，由于胎兒的血腦屏障尚未發育完成，DEHP可能通過胎盤進入胎兒的中樞神經系統，從而影響到子代的腦發育，造成神經毒性的損害［4］。DEHP可能會引起神經毒性，但國內外有關DEHP的神經毒性及其機制的系統報道較少，本研究擬通過DEHP的胚胎期暴露研究DEHP對于子代大鼠神經發育，初步探討不同劑量的DEHP對子代大鼠學習記憶的影響，為今后對DEHP的深入研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DEHP(分析純)，美國Sigma公司。玉米油，市售。

1.2 實驗動物分組與染毒 Wistar大鼠35只，其中雌性25只，雄性50只，體重200～250 g，由吉林大學基礎醫學院動物實驗中心提供，生產許可證號:SCXK-(吉)2011-0004。動物自由飲水攝食，飼料由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供，合格證號:SCXK-(吉)2010～0001。動物室溫度20～22℃，相對濕度55% ～65%，適應性飼養7 d，按體重隨機分為4組:對照組和低、中、高劑量組，每組6只。動物交配雌雄大鼠以1∶1同籠，次日晨于盤底及陰道檢查陰栓，查出陰栓者，記為妊娠0 d，母鼠編號稱重，在妊娠期7～16 d，高、中、低三劑量組每天經口灌胃給予DEHP，給予DEHP的量均為1.0 ml/100 g BW，對照組經口灌胃給予等量玉米油。同時進行如下處理。對照組:給予母鼠對照物玉米油;高劑量組:染毒母鼠DEHP 1000 mg/kg;中劑量組:染毒母鼠DEHP 750 mg/kg;低劑量組:染毒母鼠DEHP 250 mg/kg。孕鼠產子后，單獨一籠哺養幼鼠。實驗時，每籠選取雌雄兩只子代大鼠進行神經行為學測定。

1.3 仔鼠行為學改變的測定

1.3.1 跳臺實驗 實驗時，將離乳的子代大鼠置于箱中，自由活動5 min，然后將其置于安全臺上，箱底通電，觀察其跳臺的潛伏期(latency，L)并記錄5 min內仔鼠跳下臺的次數，即錯誤次數(mistake，M)，此為訓練成績，24 h后再測為測試成績。

1.3.2 避暗實驗 實驗時將離乳的子代大鼠頭部背對著洞口放入明室，仔鼠一進入暗室立即受電擊，記錄仔鼠5 min內進入暗室的錯誤次數，此為訓練成績，24 h后再測為測試成績。

1.4 統計學方法 數據采用SPSS 10.5統計軟件進行單因素方差分析。組間比較采用最小顯著差異法檢驗(LSD法)。

2 結果

2.1 DEHP對子代大鼠跳臺實驗的測定 如表1所示，跳臺實驗中高、中、低劑量組與對照組比較，錯誤次數明顯增多，平均潛伏期明顯縮短(P＜0.05)，學習記憶能力明顯減退;高劑量組與中、低劑量組比較，子代大鼠錯誤次數明顯增多，潛伏期明顯縮短(P＜0.05)。

2.2 DEHP對子代大鼠避暗實驗的測定 如表2所示，高、中、低劑量組子代大鼠進入暗箱的潛伏期縮短明顯低于對照組(P＜0.05)及子代大鼠5 min內受電擊次數明顯高于對照組(P＜0.05)，說明高、中、低劑量組子代大鼠的記憶能力明顯降低;高劑量組子代大鼠進入暗箱的潛伏期縮短與中、低劑量組比較有顯著性(P＜0.05);高劑量組子代大鼠進入暗室的錯誤次數增多與低劑量組比較有顯著性(P＜0.05)。

表1 DEHP對子代大鼠跳臺測試結果的影響(±s)

表1 DEHP對子代大鼠跳臺測試結果的影響(±s)

注:a與正常對照組比較，P＜0.05;b與高劑量組比較，P＜0.05

組別 例數 跳臺法潛伏期(s)錯誤次數正常對照組12 95.47±9.16 3.00±1.21高劑量組 12 58.48±9.25a 7.75±1.22a中劑量組 12 78.60±11.98ab 7.00±1.21a低劑量組 12 85.91±10.69ab 5.73±1.19ab

表2 DEHP對子代大鼠避暗測試結果的影響

3 討論

DEHP可經胃腸道、肺和皮膚吸收，通常以胃腸道為主要吸收途徑。進入胃腸道后，DEHP受胰腺酶和腸道內一些酶的作用，大部分迅速由雙酯轉化為單酯(MEHP)，然后被吸收。DEHP及其代謝產物主要分布于血液、肝臟、腎臟、胃腸道以及脂肪組織，其中在大鼠的睪丸組織中濃度相對較高。DEHP進入體內代謝的第一步就是水解成為單酯系列，主要在胃腸道進行［5］。DEHP進入體內后被迅速降解，美國環境保護署報道，DEHP在人體內的半衰期平均為12 h。Andral AJ［6］研究認為DEHP孕期染毒可導致子代大鼠下丘腦視前交叉區芳香化酶表達降低，活性下降。有研究表明［7］隨著DEHP濃度增高，小鼠腦組織細胞DNA的損傷隨之加重，DEHP的濃度達到125 mg/kg和375 m/kg時，其可造成DNA的顯著斷裂(P＜0.01)。另研究表明，雌性大鼠妊娠期經口灌胃DEHP染毒，可造成孕鼠著床數降低;胚胎數、活胎數減少。可見DEHP能夠通過胎盤屏障進入胚胎體內，影響胚胎發育，具有致畸性［8］。

DEHP可以通過胎盤屏障進入胎兒體內，在胎兒體內聚集，動物實驗表明其具有致畸性，可直接作用于胎兒，也可通過干擾胎盤屏障影響胎兒發育［2，3］。導致胚胎發育異常的機制目前尚不明確，已經報道以下相關機制:①DEHP可以與過氧化物酶增殖體激活體(PPAR)作用，激活PPAR的亞型，影響胎盤滋養層細胞脂類物質的代謝。②在器官形成的關鍵時期，DEHP通過影響與鋅代謝有關的基因:金屬硫蛋白-1(MT-1)、金屬硫蛋白-2(MT-2)、鋅運轉體蛋白(ZnT-1)等的表達導致畸形。③可影響某些基因的表達，進而影響胚胎發育。Hokanson等［9］在體外培養人類MCF-7細胞株，探討DEHP對基因表達的影響，結果表明DEHP可以改變許多基因的表達，其中包括FGD1和PAFAH1B1，這兩個基因對胚胎大腦發育非常重要，DEHP使這兩個基因表達下調，推測DEHP可能會影響神經系統發育并使認知功能發生障礙。本研究通過神經行為學實驗方法結果顯示，跳臺實驗中高、中、低劑量組與對照組比較，錯誤次數明顯增多，平均潛伏期明顯縮短(P＜0.05);高劑量組與中、低劑量組比較，子代大鼠錯誤次數明顯增多，潛伏期明顯縮短(P＜0.05)。避暗實驗中高、中、低劑量組子代大鼠進入暗箱的潛伏期縮短明顯低于對照組(P＜0.05)及子代大鼠5 min內受電擊次數明顯高于對照組(P＜0.05);高劑量組子代大鼠進入暗箱的潛伏期縮短與中、低劑量組比較有統計學意義(P＜0.05);高劑量組子代大鼠進入暗室的錯誤次數增多與低劑量組比較有統計學意義(P＜0.05)。說明DEHP對子代大鼠中樞神經系統損害有一定的影響，子代大鼠學習記憶能力明顯減退。目前，對DEHP的神經毒性機制尚無明確的結論，由于本次試驗的局限性，仍有待進行更加深入的研究探討。

［1］Gunnarsson D，Leffler P，Ekwurtzel E，et al.Mono-(2-ethylhexyl)phthalate stimulates basal steroidogenesis by a cAMP-independent mechanism in mouse gonadal cells of both sexes.Reproduction，2008，135:693-703.

［2］Xu Y，AgrawalS，Cook TJ，et al.Di-(2-ethylhexyl)-phthalate affects lipid profiling in fet al rat brain upon matenal exposure.Arch Toxicol，2007，1(1):57-62.

［3］Xu Y，Kanipp GT，Cook TJ.Effects of di-(2-ethylhexyl)-phthalate and its metabolites on the lipid profiling in rat HRP-1 trophoblast cells.Arch Toxicol，2006，80(5):293-298.

［4］Hokanson R，Hanneman W.DEHP，bis(2)-ethylhexyl phthalate，alters gene expression in human cells:possible correlation with initiation of fet al developmental abnormalities.Hum Exp Toxicol，2006，25(12):687-695.

［5］于淑江，安麗紅，李杰.鄰苯二甲陵二(2一乙基己基)酯毒性作用.中國公共衛生，2005，22(5):589.

［6］Andrade AJ，Grande SW.A dose-response study following in utero and lactational exposure to di-(2-ethylhexyl)Phthalate(DEHP):non-monotonic dose-response and low dose effects on rat brain aromatase activity.Toxicology，2006，227(3):185-192.

［7］潘亮，逯曉波.鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯胚胎期暴露對子代大鼠發育的影響.遼寧醫學雜志，2010，24(1):8-12.

［8］王心.鄰苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯的雌性生殖毒性研究.西安:第四軍醫大學，2009.

［9］Hokanson R，Hanneman W，Hennossey M，et al.DEHP，bis(2)-ethylhexyl phtbelate alters gene expression in human cells possible correlation with in itiatlon of fet al developmental abnomalifies.Hum Exp Toxieol，2006，25(12):687.