分光光度法測定蕪菁中總黃酮含量

梁永紅 阿提合尼木 海力茜·陶爾大洪 王松芝

維藥蕪菁的植物學名為蕪菁，來源于十字花科植物蕪菁的塊根，藥食同源，歷史悠久，療效顯著，可用支氣管炎，食欲不振，消化不良的治療。通過研究提示蕪菁藥材中含有皂苷，黃酮類，糖類及其苷，生物堿，內酯，揮發油，酚類，鞣質，氨基酸，蛋白質等化學成分［1］，并且研究了多糖的提取及含量測定，而其他相關性研究尚在進行當中。

本實驗選用了新疆9個不同產地的蕪菁藥材，按照《中國藥典》(2005)的相關規定進行實驗并且采用熒光分析法對其總黃酮含量進行了測定［2］，旨在以評價藥材的質量，并且為相關部門今后制定該藥材質量標準時提供參考依據。

1 儀器與試劑

SX721分光光度計﹙上海第三分析儀器廠﹚;索氏提取器;回流提取裝置。乙醇為分析純;5%亞硝酸鈉溶液，10%硝酸鋁溶液，4%氫氧化鈉溶液采用分析純試劑自配;蘆丁標準品﹙100080-200707，中國藥品生物制品檢定所﹚。樣品為新疆9個不同產地的蕪菁藥材

2 方法與結果

2.1 標準品溶液的制備［3］精確稱取在105℃條件下干燥至恒定質量的蘆丁標準品10.0 mg，置于100 ml容量瓶中，加入75%乙醇適量，微熱溶解解，放冷后再加入75%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度為0.10 g/L的蘆丁對照品溶液，低溫保存，備用。

2.2 供試品溶液的制備［4］精密稱取蕪菁粉末1.0 g(過60目篩，60℃干燥至恒重)置索氏提取器中，加30 ml石油醚加熱回流30 min，棄去石油醚提取液，利用余溫揮干殘留石油醚，然后加入30 ml體積分數75%乙醇加熱回流120 min，過濾，濾液置100 ml容量瓶中，用75%乙醇定容至刻度。

2.3 測定波長的選擇 精確量吸取對照品溶液和供試品溶液5 ml，分別置于25 ml容量瓶中，加入5%的亞硝酸鈉溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min，加入10% 硝酸鋁溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min，加4% 氫氧化鈉溶液10.0 ml，再加入75%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，在波長200～700 nm范圍內進行不斷縮小范圍的反復連續波長掃描，以確定波長。

2.4 標準曲線繪制 分別精確量吸取蘆丁標準液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml置于 25 ml容量瓶中，加入 5%的亞硝酸鈉溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min，加入10% 硝酸鋁溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min，加入4% 氫氧化鈉溶液10.0 ml，再加入75%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，進樣，在確定的波長處測定吸光度值(以不加標準溶液的相應溶液為空白對照)，得到標準液濃度(C)與吸光度(A)之間的回歸方程。

2.5 正交實驗設計 在預實驗的基礎上采用索氏提取法在質量，提取工藝相同條件下，考察了乙醇濃度，料液比，提取時間等因素的影響，采用正交表L9(34)安排實驗，見表1。精密稱取蕪菁粉末1.0 g于索氏提取器中進行正交實驗，精密吸取5 ml于25 ml容量瓶中按上述“2.3”方法制成測定液，測定其吸光度值。

表1 索氏提取因素水平表

2.6 回收率試驗［5］精密量取供試液1 ml，分別置于4只25 ml量瓶中，分別加入標準液 0.30，0.40，0.50，0.60 ml，再照“2.3”項的方法制成測定液，測定吸光度值，計算測定液總黃酮濃度，平均回收率及RSD值。

2.7 樣品含量測定 最佳提取條件下，照“2.2”項的方法制備成供試品溶液，精確量取供試品溶液5 ml，置25 ml容量瓶中，加入5%的亞硝酸鈉溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液10.0 ml，再加入75%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以加標準溶液的相應溶液為空白對照，在確定的波長處測定吸光度值(A)，代回歸方程計算總黃酮含量。

3 結果

3.1 提取溶劑和提取方法的選擇 因甲醇有毒，因此選用乙醇提取，用硝酸鋁顯色法，在波長510 nm處測定蕪菁中總黃酮的含量。

3.2 穩定性試驗 測定結果表明，提取液中加入顯色劑制成測定液后穩定性逐漸變差，得穩定性試驗的RSD%為1.5%，須在45 min內盡快測定為宜。提取液放置1 d后不穩定，因此應采用新鮮的提取液。

3.3 精密度、回收率試驗 精密度，回收率試驗的RSD值分別為0.85%(n=5)，1.6%(n=5)，平均加樣回收率為101.6%，表明波長為510nm的分光光度法適用于蕪菁中總黃酮的含量測定，該法操作簡便，結果可靠，重現性好。

3.4 標準曲線繪制 按上述標準液制備及標準曲線的繪制方法，得到標準溶液濃度(C)和吸光度(A)間的回歸方程為:A=0.01853 c+0.0097，r=0.9998，表明該方程在 0 ～0.020 mg∕ml范圍內呈良好的線性關系。

圖1 蘆丁標準工作曲線

3.5 正交實驗結果 把吸光度(A)代入標準曲線方程求出樣品中總黃酮含量，結果詳見表2。

3.6 最佳條件的選擇 從表2和表3的數據可知，3種因素對提取結果影響大小依次為A＞B＞C。表2可知最佳提取方案為A1B3C3，但由表3可知C因素沒有顯著性差異，從成本考慮，最佳提取方案為A1B3C1。即最佳提取條件為用30倍原料重的75%乙醇提取120 min。在此條件下，按上述方法顯色，測定其吸光度，由標準曲線計算出總黃酮質量分數為2.603%。

3.7 不同產地蕪菁總黃酮含量(%)

表2 正交實驗設計及結果表

表3 正交試驗結果的方差分析

表4 不同產地蕪菁總黃酮含量(%)

4 討論

本實驗首次采用分光光度法對新疆9個不同產地的蕪菁的塊根進行總黃酮含量的測定，測定結果見表4。從表中可以看出，各產地總黃酮含量均高于2.0%，故將總黃酮含量暫定為不得低于2.0%。最后確定的總黃酮最佳提取工藝是用30倍原料重的75%乙醇提取120 min。新疆不同地區蕪菁中總黃酮含量有明顯的不同，其中阿克蘇地區的蕪菁中總黃酮含量最高，其次是和靜的，吐魯番地區蕪菁中總黃酮含量最低，本實驗可為新疆的蕪菁產品開發提供一定的理論依據。

［1］李愛華，侯寶林，泰西京，等.新疆阿克蘇恰麻古多糖的提取及含量測定.新疆師范大學學報，2009，28(2):61-63.

［2］中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典.北京:化學工業出版社，2005:152-153.

［3］曠南岳，海力茜.維藥蕪菁藥材質量標準研究.西北藥學雜志，2010，25(6):421-423.

［4］海力茜·陶爾大洪，巴吐爾.天山巖黃芪根中總黃酮超聲提取工藝研究.時珍國醫國藥，2008，19(2):82-83.

［5］馬合木提，海力茜.紫外分光光度法測定維藥鷹嘴豆中總黃酮的含量.時珍國醫國藥，2007，19(4):889-890.