山茱萸水提取物對人肺癌A549細胞凋亡的作用

王恩軍 靳 祎 季文琦 關 宏 肖 鋒 (河北大學基礎醫學院，河北 保定 07000)

山茱萸水提取物對人肺癌A549細胞凋亡的作用

王恩軍 靳 祎 季文琦1關 宏2肖 鋒 (河北大學基礎醫學院，河北 保定 071000)

目的 探討山茱萸水提取物對人肺癌A549細胞的體外增殖的抑制及凋亡作用。方法 采用MTT法及DNA瓊脂糖凝膠電泳法檢測山茱萸水提取物對A549細胞增殖的抑制及凋亡作用，并觀察細胞形態改變。結果 山茱萸水提取物對A549細胞抑制作用較明顯，在一定范圍內呈現較好的量效、時效關系;經不同劑量的山茱萸水提取物處理的細胞電泳均出現相差約200 bp的DNA梯狀電泳圖譜，形態學觀察到細胞凋亡。結論 山茱萸水提取物對人肺癌A549的細胞增殖有較強的抑制作用，能誘導其細胞凋亡。

山茱萸水提取物;肺癌;A549;抑制作用

山茱萸是山茱萸科落葉灌木或小喬木，其干燥成熟果實為中藥，別名山萸肉、蜀酸棗、藥棗、肉棗、薯棗、棗皮、雞足、天木籽、實棗兒等，其味酸、澀、微溫，歸肝、腎經，有補益肝腎、澀精固脫之功效〔1，2〕，為我國常用的名貴中藥材。現代醫學證實山茱萸果肉中含有生理活性較強的山茱萸甙、酒石酸、沒食子酸、蘋果酸、樹酯、糖類、鞣質和維生素等多種有效成分，具有免疫調節、降低血糖、抗血小板聚集、抗菌等多種藥理作用。在抗癌研究方面，山茱萸對多種腫瘤細胞有明顯的抑制作用〔3～5〕。本試驗采用人肺癌A549細胞作為試驗模型，研究山茱萸水提取物體外抗肺癌活性，探討山茱萸的抗癌機制，為其臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

①山茱萸水提取物：由河北農業大學生命科學學院提供，每1 g相當于原生藥2 g，制成500 mg/ml的溶液，高壓滅菌4℃保存(原生藥從河北安國縣藥材公司購買);②人肺癌A549細胞：購自北京軍事醫學科學院放射研究所，后經河北農業大學生命科學學院傳代凍存提供。

1.2 試劑

RPMI 1640培養液、乙二胺四乙酸(EDTA)、胰蛋白酶(GIBCO公司);順鉑(齊魯制藥有限公司);四甲基耦氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司);瓊脂糖(北京拜爾迪生物公司);200 bp DNA marker(華美生物工程有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 實驗采用體外培養的A549細胞系，經0.25%胰蛋白酶加0.02%EDTA消化后吹打，1 500 r/min離心，稀釋至細胞濃度1×105個/ml。接種在96孔培養板上，每孔200 μl。空白孔只加培養液不加細胞，每組設4個平行孔，置于 37℃、5%CO2的培養箱中培養 24 h〔6〕。

1.3.2 藥物敏感性試驗 待細胞貼壁后，實驗組每孔加入不同劑量的山茱萸水提取物，分別為每孔 10，20，40，80 μl，使藥物終濃度分別為25、50、100、200 mg/ml。放入培養箱分別培養24、48 h和72 h。以終濃度為20 μg/ml的順鉑作為陽性對照，以生理鹽水作為陰性對照。

1.3.3 MTT法檢測山茱萸水提取物體外抗腫瘤活性 待藥物作用細胞規定時間后，取出培養板，每孔加入5 μg/μl的MTT液 20 μl，繼續培養 4 h，吸掉培養液，每孔加入 DMSO 150 μl，震蕩15 min，于酶標儀上在570 nm波長下測定各孔吸光度值(A值)，計算不同劑量的山茱萸水提取物對細胞增殖的抑制率(GIR)，所有試驗重復3次。增殖細胞抑制率(%)=(1-實驗組A值 /空白對照組A值)×100%。

1.3.4 形態學觀察 取對數生長期的A549細胞接種于48孔細胞培養板內，培養24 h，實驗組每孔加入20 μl的山茱萸水提取物，對照組加入生理鹽水，培養48 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態變化。

1.3.5 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析 取對數生長期細胞5瓶，每瓶共含有1×106個細胞，用細胞培養液把山茱萸水提取物稀釋成不同濃度(終濃度為 0、25、50、100、200 mg/ml)，分別加入5個培養瓶中，加培養液至5 ml，培養48 h后，收集細胞，用PBS洗2次;加細胞裂解液，再加蛋白酶K，振搖使懸液混勻，50℃過夜;冷卻后加入等體積的飽和酚溶液，混合后離心，吸出上層水相，移至另一離心管中，重復抽提，直到無蛋白為止;吸上清加入氯仿/異戊醇(24∶1)再抽提一次，吸取水相層加入1/10體積的醋酸鈉溶液混勻，再加入冷無水乙醇，離心，收集沉淀，70%乙醇漂洗2次，晾干;加入TE緩沖液融解DNA，再加入RNA酶，置37℃作用30 min，取10 μl提取的各組DNA樣品液與上樣緩沖液按4∶1混勻后點樣，在2%瓊脂糖凝膠上電泳2 h，電壓為80 V，取凝膠到凝膠成像儀上拍照分析。

1.4 統計學方法 組間比較行t檢驗。

胎牛血清(中國醫學科學院生物工程研究所);

2 結果

2.1 山茱萸水提取物對A549細胞抑制作用的量效關系

A549細胞經不同劑量的山茱萸水提取物處理48 h后，均顯示較明顯的細胞抑制作用，實驗組與對照組比較，A值差異有統計學意義(P＜0.05)。其抑制率隨濃度的降低有所下降，在一定范圍內呈濃度依賴關系(量效關系)。見表1。

2.2 山茱萸水提取物對A549細胞抑制作用的時效關系

4種不同劑量的山茱萸水提取物作用于A549細胞24、48、72 h，隨著作用時間的延長，抑制作用明顯增強(時效關系)。見表2。

2.3 形態學觀察

對照組肺癌A549細胞生長良好，密度較大，部分重疊成簇，為長梭形或多角形，排列無方向，細胞邊緣清楚;A549細胞經山茱萸水提取物處理后，細胞體積縮小，數量減少，逐漸變為圓形，與周圍的細胞分離，培養液中可見許多漂浮的顆粒。

2.4 DNA凋亡帶的觀察

A549細胞經不同濃度山茱萸水提取物處理48 h后，除空白對照外的細胞，電泳檢測均可見DNA有規律的降解，形成了特征性的梯狀條帶(DNA ladder)，表明一定量的山茱萸水提取物可誘導A549細胞凋亡。

表1 不同劑量的山茱萸水提取物對A549細胞增殖的抑制作用(n=4s)

表1 不同劑量的山茱萸水提取物對A549細胞增殖的抑制作用(n=4s)

與對照組比較：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

組別 劑量 吸光值 抑制率(%)陰性對照組- 0.370±0.002 -陽性對照組 20 μg/ml 0.042±0.0042) 88.47±0.23山茱萸水提物 25 mg/ml 0.193±0.0031) 47.76±0.18 50 mg/ml 0.184±0.0041) 50.24±0.36 100 mg/ml 0.173±0.0012) 53.00±0.33 200 mg/ml 0.132±0.0032)64.17±0.22

表2 山茱萸水提取物不同作用時間對A549細胞的抑制率(n=4 ± s，%)

表2 山茱萸水提取物不同作用時間對A549細胞的抑制率(n=4 ± s，%)

與前一時間點比較：1)P＜0.05

濃度(mg/ml)24 h 48 h 72 h 25 42.34±0.27 47.76±0.181) 50.00±0.411)50 50.01±0.24 50.24±0.361) 53.69±0.211)100 47.29±0.15 53.00±0.331) 59.27±0.321)200 58.44±0.15 64.17±0.221) 70.33±0.161)

3 討論

肺癌是目前全世界的頭號癌癥殺手，近年來其發病率和死亡率呈明顯上升趨勢，均占癌癥首位〔7〕，每年因肺癌死亡的人數多于乳腺癌、腸癌和前列腺癌死亡人數的總和，臨床通常采取手術、放化療、免疫及中藥等多學科綜合治療。目前針對腫瘤生長的某些主要環節研制安全有效的抗腫瘤藥物是現在藥物開發的新的發展方向，隨著中醫對肺癌的認識的深入，臨床療效不斷提高，中醫藥療法已成為治療中晚期肺癌的主要方法之一，人們在研究中已發現有些中藥不但能夠有效地誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤增殖，而且還可以抑制腫瘤細胞向周圍組織的侵襲〔8，9〕。

臨床藥理研究表明山茱萸具有免疫調節、降低血糖、抗血小板聚集、抗休克、強心作用、抗心律失常、抗菌、抗炎、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗艾滋病和治療不育癥等作用，目前報道較多的有其抗衰老、增強免疫的作用，而其他研究卻甚少。

本試驗山茱萸水提取物對A549細胞增殖有較強的抑制作用，抑制程度與山茱萸水提取物的濃度和作用時間有關，濃度越高、作用時間越長對A549細胞的抑制作用越好，量效關系和時效關系明顯。另外細胞毒性的形態學觀察結果顯示山茱萸水提取物作用于細胞后，可看到細胞圓縮，由貼壁生長轉為逐漸脫落，細胞間出現明顯空隙，細胞凋亡的特征明顯。

染色體DNA的降解是細胞凋亡的標志。在細胞凋亡的后期，半胱氨酸蛋白酶激活的內源性核酸內切酶切斷了核小體間的染色體DNA，雙鏈斷裂，由此產生了一系列大小為180至220堿基的DNA碎小片段，這些片段在凝膠電泳上通過染色呈現出“階梯”樣。經山茱萸水提取物作用的A549細胞DNA提取有DNA Ladder凋亡條帶的出現，說明山茱萸水提取物能誘導A549細胞凋亡，這為今后進一步研究山茱萸的抗腫瘤作用機制提供了試驗依據。

1 張 聰，金德莊.山茱萸的研究進展〔J〕.上海醫藥，2008;29(10)：464-7.

2 李滿郁，王艷銘，楊立偉.山茱萸藥理作用研究〔J〕.中醫藥信息，2005;22(4)：33.

3 張蘭桐，袁志芳，杜英峰，等.山茱萸的研究近況及開發前景〔J〕.中草藥，2004;35(8)：952-5.

4 劉 洪，許惠琴.山茱萸及其主要成分的藥理學研究進展〔J〕.南京中醫藥大學學報，2003;19(4)：254-6.

5 季宇彬.中藥多糖的化學與藥理〔M〕.北京：人民衛生出版社，2005：226-30.

6 李宜明，沈業壽，王 清，等.抗腫瘤藥物的篩選方法〔J〕.安徽大學學報，2005;29(1)：90-6.

7 孫建立.中醫藥治療肺癌的機理研究概況〔J〕.上海中醫藥大學學報，2001;15(1)：61-4.

8 王玉芝，蒲 斌.中藥誘導腫瘤細胞凋亡研究進展〔J〕.中國中西醫結合外科雜志，2004;10(4)：331-3.

9 張 萱，張培彤.近20多年來治療肺癌中草藥研究概況〔J〕.中國腫瘤，2002;11(6)：330-2.

R734.2

A

1005-9202(2012)23-5184-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.038

保定市科技局科學研究與發展計劃項目(09ZF011);河北省人口與計劃生育委員會科研計劃項目(2009-B18)

1 河北大學醫學培訓中心 2 保定市第一中心醫院急診科

王恩軍(1977-)，男，講師，碩士，主要從事抗腫瘤中藥及藥理研究。

〔2011-07-25收稿 2011-12-12修回〕

(編輯 曹夢園)