半枝蓮多糖對C26荷瘤小鼠caspase-3，8，9活性的影響

葉 華 郭 蒙 吳 瓊 朱宇珍 鄭學寶

(廣東醫學院廣東天然藥物研究與開發重點實驗室，廣東 湛江 524023)

半枝蓮多糖對C26荷瘤小鼠caspase-3，8，9活性的影響

葉 華 郭 蒙1吳 瓊1朱宇珍 鄭學寶

(廣東醫學院廣東天然藥物研究與開發重點實驗室，廣東 湛江 524023)

目的 觀察半枝蓮多糖(SPS)對C26荷瘤小鼠caspase-3，8，9活性的影響。方法 通過腋下接種C26結腸癌細胞建立小鼠移植瘤模型，SPS作用10 d后，根據腫瘤重量計算抑瘤率評價SPS對腫瘤生長的影響，分光光度法檢測腫瘤組織中caspase-3，8，9活性。結果 與模型組比較，SPS可以抑制腫瘤的生長，提高腫瘤組織中caspase-3和caspase-9的活性，而caspase-8活性沒有明顯改變。結論 SPS可能通過活化caspase-9，進而激活caspase-3誘導腫瘤細胞凋亡而發揮抗腫瘤作用。

半枝蓮多糖;半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶;凋亡;腫瘤

結腸癌是常見的惡性腫瘤之一，以40～50歲年齡組發病率最高，全球每年新發病例約800萬人，占所有惡性腫瘤的10%～15%。結腸癌在我國的發病率有增高的趨勢，死亡率僅次于肺癌和肝癌，占我國惡性腫瘤第三位。近年來，隨著西妥昔和貝伐單抗等新型靶向藥物的臨床應用，患者的生存率有了提高〔1，2〕，但僅限于 KRAS 為野生型的腫瘤〔3〕。天然產物是新藥研發中的重要領域，半枝蓮多糖是從半枝蓮中提取的有效成分之一，研究顯示可抑制 S180、H22荷瘤小鼠腫瘤的生長〔4，5〕。本文通過建立小鼠結腸癌模型，觀察半枝蓮多糖(SPS)對凋亡相關蛋白caspase-3、caspase-8和caspase-9的影響，探討半枝蓮多糖的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

院實驗動物中心提供;C26結腸癌細胞，北京協和醫學院藥理教研室惠贈;半枝蓮多糖，本室自制;5氟尿嘧啶(5-FU)，上海

BALB/C小鼠，18～22 g，雌雄各半，廣東醫學旭東海普藥業有限公司;RPMI-1640，美國GIBCO公司;caspase-3分光光度法檢測試劑盒，南京凱基生物科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 BALB/C鼠源性結腸癌細胞系C26，用含10%胎牛血清1 640培養基在37℃、5%CO2條件下常規培養。

1.2.2 荷瘤小鼠模型的建立 收集對數生長期的C26結腸癌細胞，用生理鹽水稀釋成含量為1×107/ml的細胞懸液。小鼠右側腋窩皮下接種0.2 ml細胞懸液，10 d后將生長旺盛期的瘤組織剪切成1 mm3左右，在無菌條件下，接種于小鼠右側腋窩皮下，如此傳3代后，大批接種小鼠腋下，制備實體瘤模型。

1.2.3 分組及給藥 將接種C26細胞24 h后的小鼠隨機分為5組，每組各10只。模型組，每天灌胃給予NS 0.1 ml/10 g;5-FU 組，腹腔注射給予5-FU 15 mg·kg-1·d-1，SPS 低、中、高劑量組分別灌胃給予 SPS 50、100、200 mg·kg-1·d-1(用 NS配制)。連續給藥10 d。

1.2.4 對荷瘤小鼠抑瘤率的影響 末次給藥24 h后，頸椎脫臼處死，常規取實體瘤稱重，計算腫瘤生長的抑制百分率(抑瘤率)。抑瘤率=(模型組平均瘤重-治療組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%。

1.2.5 caspase-3，8，9活性測定 將腫瘤組織置于培養皿中，手術剪剪碎成3 mm×3 mm左右的小塊，加入冰冷的裂解緩沖液，冰上制備勻漿，勻漿液10 000 r/min，4℃離心5 min后收集上清，測定其中的蛋白濃度，按照試劑盒操作要求，通過酶標儀檢測腫瘤組織中caspase3，8，9活性。

1.3 統計學方法

應用SPSS13.0軟件處理數據，采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 SPS對 C26結腸癌小鼠瘤重的影響

50、100和200 mg·kg-1·d-1SPS均能抑制C26結腸癌在小鼠體內的生長，抑瘤率分別為13.12%、31.57%和38.55%，顯示出一定的劑量依賴趨勢，100、200 mg·kg-1·d-1劑量組與模型組相比有顯著性差異(P＜0.01)。見表1。

2.2 SPS對荷瘤小鼠caspase-3，8，9活性的影響

與模型組相比，SPS可以提高荷瘤小鼠腫瘤組織中caspase-3和caspase-9的活性，而且隨著給藥劑量的增加，caspase-3和caspase-9活性逐漸上升，高劑量組活性升高最為明顯，其中 100、200 mg·kg-1·d-1劑量組有顯著性差異(P＜0.01)。SPS各劑量組caspase-8的活性與模型組相比沒有明顯變化。見表2。

表1 SPS對C26結腸癌小鼠瘤重的影響± s，n=10)

表1 SPS對C26結腸癌小鼠瘤重的影響± s，n=10)

與模型組比較：1)P＜0.01，下表同

組別 體重(g)治療前 治療后瘤重(g)抑瘤率(%)模型組20.32±0.90 21.48±1.03 0.80±0.18 -5-FU組 20.3±1.20 17.94±1.21 0.35±0.111) 56.00低劑量SPS組 20.24±1.05 21.24±0.91 0.70±0.16 13.12中劑量SPS組 20.09±0.95 22.22±1.01 0.55±0.141) 31.57高劑量SPS組 20.42±0.77 21.12±0.92 0.49±0.121)38.55

表2 SPS對C26荷瘤小鼠 caspase-3，8，9活性的影響(± s，n=10)

表2 SPS對C26荷瘤小鼠 caspase-3，8，9活性的影響(± s，n=10)

組別caspase-3 caspase-8 caspase-9模型組0.217±0.088 0.205±0.069 0.261±0.054 5-FU組 0.486±0.0821) 0.546±0.0581) 0.521±0.0841)低劑量SPS組 0.301±0.041 0.22±0.096 0.346±0.082中劑量SPS組 0.338±0.0421) 0.254±0.102 0.527±0.0691)高劑量SPS組 0.416±0.0671) 0.257±0.048 0.657±0.0711)

3 討論

半枝蓮是一種天然草藥，具有清熱解毒、活血祛瘀、消腫止痛、抗癌等功能，民間常用于治療毒蛇咬傷、跌打損傷、吐血、衄血、血淋、水腫、腹水及癌癥等，特別是在癌癥的治療中，臨床上常與白花蛇舌草、半邊蓮等組成復方配伍用于多種腫瘤的治療。SPS是從半枝蓮中提取的主要有效成分。研究發現SPS可以抑制S180、H22荷瘤小鼠腫瘤的生長，與環磷酰胺合用具有增效減毒作用〔6〕，表明SPS具有潛在抗腫瘤研究價值。

在本研究中，SPS可以顯著抑制C26結腸癌荷瘤小鼠腫瘤的生長，并呈一定的劑量依賴趨勢。腫瘤的發生不僅與細胞的異常增殖和分化有關，也與細胞凋亡的異常有關，凋亡調控失調是腫瘤發生的重要原因之一〔7〕。放療化療等多種抗腫瘤治療的部分機制與誘導凋亡有關，許多抗腫瘤藥物都在一定程度上可誘導腫瘤細胞發生凋亡〔8〕。因此，我們進一步觀察SPS對荷瘤小鼠腫瘤組織中凋亡相關蛋白 caspase-3、caspase-8和caspase-9的影響。

caspase-3，是caspase家族中最重要的凋亡執行者之一，是細胞凋亡過程中的主要效應分子，它的活化標志著凋亡進入不可逆階段〔9〕。caspase-8是外源性凋亡途徑的主要蛋白。Fas與FasL(Fas ligand)結合，將死亡信號傳遞到細胞內，通過內源性Fas相關死亡結構域(FADD)生成FasL-Fas-FADD凋亡復合物，使 caspase-8活化，激活下游的 caspase-3、6、7，導致細胞凋亡〔10〕。caspase-9是內源性凋亡途徑的關鍵分子。當線粒體釋放細胞色素C，與凋亡相關因子1(Apaf-1)結合，形成多聚體，并促使caspase-9與其結合形成凋亡小體，caspase-9被激活，活化的caspase-9能激活其他的caspase如caspase-3等，從而誘導細胞凋亡〔11〕。

本研究結果顯示SPS可以提高C26結腸癌荷瘤小鼠腫瘤組織caspase-3和caspase-9的活性，而caspase-8活性沒有明顯變化，提示caspase-3和caspase-9參與了SPS對腫瘤的抑制作用，SPS可能通過線粒體啟動的內源性凋亡途徑，活化caspase-9，進而激活caspase-3誘導腫瘤細胞凋亡而發揮抗腫瘤作用。

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4 葉 華，崔 燎.半枝蓮多糖的抗肝癌作用及其機制的研究〔J〕.癌癥進展，2009;7(3)：331-4.

5 張秀娟，張 晶，楊姍姍.半枝蓮多糖對小鼠S180肉瘤及免疫功能的影響〔J〕. 齊魯藥事，2008;27(10)：828-30.

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Effect of Scutellaria barbata polysaccharides on caspase-3，8，9 activity in C26 tumor bearing mice

YE Hua，GUO Meng，WU Qiong，et al.
Guangdong Key Laboratory for Research and Development of Natural Drugs，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023，Guangdong，China

Objective To study the effect of Scutellaria barbata polysaccharides(SPS)on caspase-3，8，9 activity in C26 tumor bearing mice.Methods The C26 tumor bearing mouse model was established and the inhibitory rate of SPS was detected.The activity of caspase-3，8，9 were monitored by spectrophotometry.Results Compared with model group，SPS inhibited the development of transplanted tumor in mice，increased the activity of caspase-3 and caspase-9，but did not change the activity of caspase-8.Conclusions SPS maybe induce tumor apoptosis by activating caspase-9，then activate caspase-3.

Scutellaria barbata polysaccharides;Caspases;Apoptosis;Tumor

R966

A 〔

1005-9202(2012)23-5152-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.025

國家自然科學基金(30772701);廣東省科技計劃項目(2011B03170065);廣東省建設中醫藥強省項目(20112144);湛江市科技攻關項目(2009C3104003)

1 廣東醫學院藥理教研室

鄭學寶(1964-)，男，教授，博士生導師，博士，主要從事中藥及中藥復方藥理學研究。

葉 華(1980-)，女，碩士，主要從事抗腫瘤和抗炎免疫藥理學研究。

〔2012-07-30收稿 2012-10-10修回〕

(編輯 曹夢園)