微波對人肺癌A549細胞凋亡的非熱效應

曹慧玲 徐 冶 劉曉冬 于 洋 劉師兵 王曉軍 孫路陽 李玉璞

(吉林醫藥學院，吉林 吉林 132013)

微波對腫瘤細胞的熱損傷已廣泛應用，特別對中心型支氣管肺癌局部姑息治療有重要意義。熱效應之外的非熱效應對腫瘤細胞的促凋亡作用日益引起重視，探討微波非熱效應對腫瘤細胞的影響，對減少照射劑量、減輕局部副損傷有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料 IMDM培養基、新生牛血清購于Gibco公司;一抗購自美國Santa Cruz公司;二抗、DAB及Hoechst 33342熒光染料購于北京鼎國公司;A549細胞：由吉林大學贈送，用含10%新生牛血清的IMDM培養液，置CO2培養箱(37℃、5%CO2)培養，隔2～3 d傳代1次，取生長狀態良好對數生長期細胞進行實驗。微波儀：南京匯研MY8C-1型微波功率源。流式細胞儀：EPICS XL，Beckman。共聚焦顯微鏡：Olympus FV1000。

1.2 方法 將A549細胞分為空白對照組、低照射劑量組(100 W，照射強度12 mV/cm2)、中照射劑量組(150 W，照射強度18 mV/cm2)和高照射劑量組(200 W，照射強度為21 mV/cm2)，每組均在冰浴條件下〔1〕照射10 min。照射后24 h光鏡下觀察照相、收集細胞。

1.2.1 Western印跡法檢測蛋白表達 待細胞生長到對數生長期時，離心收集細胞，每瓶加入120 μl細胞蛋白裂解液RIPA，混勻，細胞粉碎儀超聲細胞2次，充分裂解細胞，離心收集上清，采用Bio-Rad法測定蛋白含量。SDS-PAGE電泳分離蛋白利用濕轉法將分離膠上蛋白轉移到PVDF膜上。轉膜完成后，用5%脫脂奶粉封閉1 h，PBST洗3次，加入相應一抗(1∶200稀釋)4℃過夜。第二天，PBST洗3次，加入過氧化物酶標記二抗(1∶1 000稀釋)，搖床搖1 h;PBST洗3遍。DAB顯色，凝膠成像系統拍照;同時以β-actin作為內參照。

1.2.2 Rh123染色檢測細胞凋亡 消化并收集細胞，PBS洗2次，取2×106個細胞，加 Rh123染液5 μg/ml，37℃避光孵育30 min，PBS洗2次，重懸于500 μl PBS中，流式細胞儀檢測。

1.2.3 間接免疫熒光、Hoechst 33342染色檢測細胞凋亡 取細胞密度1×105/ml置于24孔板中，每孔500 μl接種過夜。爬片固定后經0.1%Triton-PBS作用5 min，非免疫山羊血清封閉30 min，加入一抗4℃過夜;洗滌后加入熒光二抗30 min，洗滌后抗熒光淬滅劑封片。Hoechst 33342染色法省去一抗和二抗孵育步驟，直接加入Hoechst 33342染色液室溫15 min，洗滌后抗熒光淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3 統計學分析 采用SPSS11.0軟件進行分析，計量資料以s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 不同劑量微波照射A549細胞后光鏡下形態變化 與對照組相比，照射劑量越大細胞數減少越明顯，細胞回縮變圓，細胞質越致密。見圖1。

2.2 不同劑量微波照射A549細胞后流式分析凋亡結果 隨著微波照射強度的增加，A549細胞結合Rh123的能力下降，高熒光密度群百分率減少、平均熒光密度下降、低熒光密度群百分率增加(2.9%vs 5.4%、7.6%、9.9%;P＜0.01)。見圖2。

2.3 不同劑量微波照射A549細胞后Hoechst 33342與間接免疫熒光染色共聚焦檢測凋亡結果 微波照射A549細胞后，間接免疫熒光法檢測到細胞凋亡蛋白caspase3活化增多，熒光強度隨劑量的增加而增強。A549細胞被微波照射后，藍色熒光強度隨著照射劑量的增大而增高，核碎裂細胞增多。見圖3，圖4。

2.4 不同劑量微波照射后Western印跡檢測凋亡蛋白變化

各照射組Bax/Bcl-2均高于對照組(P＜0.01)，照射劑量越大該比值越高;各照射組Caspase3均高于對照組(P＜0.01)，照射劑量越大，該值越高。見圖5，圖6。

圖1 微波作用A549細胞光鏡變化(×200)

圖2 微波作用A549細胞后Rh123染色流式細胞儀檢測線粒體膜電勢變化

圖3 Hoechst 3342染色共聚焦顯微鏡檢測細胞凋亡

圖4 間接免疫熒光法共聚焦顯微鏡檢測活性caspase3

圖5 微波作用A549細胞后凋亡蛋白表達變化

圖6 Western印跡結果統計分析

3 討論

微波在醫療方面有著廣泛的應用。高強度微波主要顯現的是熱效應，而低強度產生的非熱效應對生物體的影響和作用機制均不明確〔2〕。與正常細胞比較，腫瘤細胞的特點是凋亡減少、增殖旺盛。已有資料表明：暴露于非熱的微波中可誘發人上皮癌KB細胞凋亡且呈時間依賴性〔3〕。因此，關注微波非熱效應是否能誘導人肺癌A549腫瘤細胞凋亡及其機制，探索低強度微波在生物治療領域的應用價值顯得尤為重要。

有實驗用加熱處理擯除微波熱效應的影響，強烈提示微波對微生物存在著明顯的非熱效應〔4〕。本實驗采用的是在冰浴摒除熱效應條件下，不同劑量微波照射10 min后24 h光鏡觀察：結果顯示，隨著照射劑量增大，細胞數減少明顯，細胞回縮變圓，細胞核輪廓不清，細胞質致密，符合凋亡前細胞的非特異性變化。在微波輻射誘導下定位于線粒體的Bcl-2表達下降、Bax表達上升，定位于胞質的Caspase3增加，此過程促進了線粒體途徑的細胞凋亡。線粒體是真核細胞的重要細胞器，是動物細胞生成ATP的主要地點。線粒體跨膜電位的耗散與細胞凋亡有密切關系。微波能夠影響膜的通透性及膜電位，導致電穿孔〔5〕。隨著照射強度的增加，A549細胞膜電位發生了變化，使其結合Rh123的能力明顯下降，表現為Rh123染色顯示低熒光密度群百分率顯著增加;凋亡細胞膜通透性增強，使Hoechst 33342能較多地進入其中，同時凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷，不能有效地將Hoechst 33342排出到細胞外，使之在細胞內積累，表現為熒光強度增高。

本實驗表明微波的非熱效應對人A549細胞有明顯的促凋亡作用。微波非熱作用除促進細胞凋亡外，還通過改變離子通道、誘發氧自由基等途徑〔6〕破壞腫瘤細胞。這些作用尚需更多實驗數據證明。

1 謝長宜，王 易.微波非熱效應對雜交瘤細胞的影響研究〔J〕.自然雜志，2000;22(5)：305-6.

2 Sannino A，Sarti M，Reddy SB，et al.Induction of adaptive response in human blood lymphocytes exposed to radiofrequency radiation〔J〕.Radiat Res，2009;171(6)：735-42.

3 Caraglia M，Marra M，Mancinelli F，et al.Electromagnetic fields at mobile phone frequency induce apoptosis and inactivation of the multi-chaperone complex in human epidermoid cancer cells〔J〕.J Cell Physiol，2005;204(2)：539-48.

4 王曉慶，張澤華，王廣軍，等.微波場對微生物DNA的作用研究〔J〕.中國消毒學雜志，2009;26(1)：1-4.

5 盧恩勇，徐向民，賴聲禮.微波的生物效應及研究進展〔J〕.廣州醫藥，2005;36(1)：4-7.

6 楊少華.2450MHz微波生物學效應的研究進展〔J〕.華夏醫學，2006;19(1)：172-4.