單向灌流法評(píng)價(jià)梔子厚樸湯方劑配伍對(duì)梔子苷腸吸收的影響*

汪 汀 ，馮 芳 ，2**

中國(guó)藥科大學(xué) 1藥物分析教研室；2藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009

梔子厚樸湯出自《傷寒論》[1]，由梔子、厚樸、枳實(shí)三味藥材組成。方中梔子苦寒，清熱除煩；厚樸苦溫，行氣消滯；枳實(shí)苦寒，破結(jié)消痞。梔子厚樸湯作為重要的抗焦慮方劑開始受到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。方中梔子藥材具有抗焦慮[2]、抗抑郁[3]相關(guān)藥理作用已見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期關(guān)于梔子厚樸湯藥效物質(zhì)研究結(jié)果也表明，方中梔子藥材在抗抑郁藥效中發(fā)揮著一定作用[4]。但其活性成分梔子苷的極性較大，根據(jù)經(jīng)典理論推測(cè)為吸收較差物質(zhì)[5]，這可能是其生物利用度低的主要原因之一。本文以梔子中主要活性成分梔子苷為指標(biāo)，考察了梔子提取物、梔子與枳實(shí)、厚樸配伍以及梔子厚樸湯全方使用后的梔子苷的腸吸收變化，探討中藥復(fù)方用藥與單味用藥的吸收差異，說明中醫(yī)復(fù)方配伍用藥的科學(xué)性。

1 材 料

1.1 儀器

LC-2010C高效液相色譜儀、LC-solution工作站（島津，日本）；TGL-16B型高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Libror AEC-210電子天平（島津，日本）。

1.2 藥材與試劑

梔子 （產(chǎn)地江西，批號(hào)：091222，南京建軍藥店）；枳實(shí)（產(chǎn)地江西，批號(hào)：100118，南京先聲藥店）；厚樸（產(chǎn)地四川，批號(hào)：100109，南京先聲藥店）。以上藥材經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)秦民堅(jiān)教授鑒定：梔子為茜草科植物梔子 （Gardenia jasminoides Ellis.）的干燥果實(shí)；枳實(shí)為蕓香科植物酸橙（Citrus aurantium L.）的干燥幼果；厚樸為木蘭科植物厚樸（Magnolia officinalis Rehd.Et Wils.）的干燥樹皮、根皮及枝皮。以上三味藥材粉碎，過60目篩，待用。

梔子苷對(duì)照品（純度≥98.0%，成都康邦生物技術(shù)有限公司）；甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）；其余試劑均為市售分析純；Krebs-Ringer's試劑（簡(jiǎn)稱K-R液）自配；水為純凈水。

1.3 動(dòng)物

健康 SD 大鼠（普通級(jí)），雄性，（200±20）g，購(gòu)自南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖中心，合格證號(hào)：SCXK（蘇）2012-0001。

2 方 法

2.1 湯劑的準(zhǔn)備

2.1.1 梔子厚樸湯取梔子9 g、枳實(shí)10 g、厚樸62.4 g，加 10 倍量（1∶10，w/v）水浸泡 0.5 h 后，武火煮沸、文火煎煮1 h，如此再分別以8倍量、5倍量水同法煎煮，合并3次煎煮濾液，適當(dāng)濃縮后轉(zhuǎn)移至200 mL量瓶中，用水定容，即得梔子厚樸湯（ZZHPD）。

2.1.2 方藥不同配伍湯劑A：梔子9 g；B：梔子（9 g）-枳實(shí)（10 g）；C：梔子（9 g）-厚樸（62.4 g）。 分別按與ZZHPD相同煎煮方法制備，即得梔子湯劑（ZZ）；梔子-枳實(shí)湯劑（ZZ-ZS）；梔子-厚樸湯劑（ZZ-HP）。

2.1.3 湯劑中梔子苷含量測(cè)定ZZHPD及其不同配伍湯劑中梔子苷的含量測(cè)定參考文獻(xiàn)[6]。

2.2 梔子厚樸湯及方藥不同配伍梔子苷腸吸收參數(shù)的測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制取梔子苷對(duì)照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋配制成濃度為10mg·mL-1的對(duì)照品貯備液。分別精密移取儲(chǔ)備液適量，加甲醇稀釋，制得梔子苷濃度分別為1000、800、600、400、200、100 μg·mL-1的系列梔子苷對(duì)照品溶液。

2.2.2 腸灌流液的配制按照“2.1”項(xiàng)下方法準(zhǔn)備梔子厚樸湯以及方藥不同配伍湯劑，并計(jì)算各湯劑中梔子苷含量，分別量取ZZ、ZZ-ZS、ZZ-HP、ZZHPD湯劑適量，置100 mL量瓶中，加K-R液稀釋至刻度， 得到梔子苷含量約為65 μg·mL-1的ZZ、ZZZS、ZZ-HP、ZZHPD 腸灌流液。

2.2.3 色譜條件色譜柱：Phceda C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%乙酸水溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序如下：30%A（0～16 min），30%～95%A（16～22 min），95%～30%A（22～27 min），30%A（27～30 min）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.4 在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕7-8]24只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)等分為4組，在灌流實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。腹腔注射20%烏拉坦（5 mL·kg-1）麻醉，背位固定于手術(shù)臺(tái)上，沿大鼠腹中線剪口約3 cm，打開腹腔，在所考察的試驗(yàn)?zāi)c段（從胃部幽門下行1 cm處開始沿小腸下行至盲腸上端1 cm的全段小腸）的兩端處各剪一個(gè)小V型口，小心插入硅膠管并結(jié)扎，注意避免傷及血管，恰當(dāng)擺向?qū)嶒?yàn)?zāi)c段使灌流液能流通順暢為宜，傷口用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋保濕，紅外燈保溫。以預(yù)熱的生理鹽水（37℃）從小腸上端開口輕緩沖洗腸道（方向勿相反），直至將小腸的內(nèi)容物排除干凈為止，通空氣排凈生理鹽水，接著用預(yù)熱的腸灌流液（37℃）進(jìn)行在體單向灌流，以建立灌流體系，灌流方向要與腸道沖洗方向一致。實(shí)驗(yàn)開始前以實(shí)驗(yàn)灌流液（37℃）灌充腸段，以 0.2 mL·min-1的速度平衡 l h后，從第一滴供試液滴下開始計(jì)時(shí)，進(jìn)口處用己知重量的裝有實(shí)驗(yàn)灌流液的小瓶灌流，恒流泵保持流速不變，同時(shí)出口處放另一已知重量的小瓶收集流出腸液，每隔15 min迅速更換下一個(gè)稱重好的盛有實(shí)驗(yàn)灌流液的小瓶和空的收集液小瓶，放冷至室溫后，稱量灌流液小瓶和收集液小瓶的重量，共收集8個(gè)時(shí)間段（K1～K8）的樣品，實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為120 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠小腸剪下，沿腸管剪開，平鋪于坐標(biāo)紙上，測(cè)量小腸長(zhǎng)度與內(nèi)徑。本實(shí)驗(yàn)分別以梔子苷含量約為 65 μg·mL-1的 ZZ、ZZ-ZS、ZZ-HP、ZZHPD腸灌流液進(jìn)行灌流，并收集每個(gè)時(shí)間段的灌流流出液，用已建立的HPLC法測(cè)定入口灌流液濃度，并分別測(cè)定每只動(dòng)物收集到的8個(gè)時(shí)間段的出口灌流液中梔子苷的準(zhǔn)確濃度。

2.2.5 腸灌流液樣品處理準(zhǔn)確量取200 μL空白腸灌流液樣品或含藥腸灌流液樣品，加入200 μL甲醇，旋渦混勻，16000 r·min-1離心 20 min，取上清液，即得空白腸灌流液或含藥腸灌流液的待測(cè)樣品，進(jìn)樣20 μL，進(jìn)行HPLC法分析。

2.2.6 大鼠腸吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析將腸灌流液樣品按“2.2.5”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算各時(shí)間段接收的腸灌流液中的梔子苷含量，以重量計(jì)算各組的吸收速率常數(shù)（Ka）和小腸有效滲透系數(shù)（Peff），并采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組灌流液梔子苷的吸收參數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。公式為：

Cout和Cin分別為腸道流出液、灌入液的濃度（μg·mL-1），Qin為腸道入口灌流液的流量（mL·min-1），V為灌流腸段的體積（mL），A為灌流腸段的表面積（cm2），Vin和Vout分別為灌入和流出收集的灌流液體積（mL）。L為實(shí)驗(yàn)?zāi)c段的長(zhǎng)度（cm），R為小腸半徑（cm）（采用重量法計(jì)算，假設(shè)進(jìn)出口的溶液密度一樣，并用灌入液和流出液的質(zhì)量分別表示灌入液和流出液的體積）。

3 結(jié) 果

3.1 專屬性考察

按“2.2.4”項(xiàng)下方法制作大鼠在體小腸單向灌流模型，但腸灌流液為不含任何藥物的K-R液，收集灌流流出液作為空白灌流腸液樣品。按照“3.2”項(xiàng)下方法，制備含藥灌流腸液，按“2.2.5”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明：空白灌流腸液與湯劑中其他成分不干擾測(cè)定。見圖1。

圖1 專屬性色譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和最低定量限

取大鼠空白灌流腸液6份，每份180 μL，分別加入梔子苷系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，使含藥腸灌流液梔子苷濃度為：10、20、40、60、80、100 μg·mL-1。 按“2.2.5”項(xiàng)下操作，同法處理空白灌流腸液進(jìn)樣，記錄色譜圖。以腸灌流液中梔子苷的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），用最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，得線性方程為：Y=1.564×104X+3.313×102（r=0.9999）。 梔子苷的最低定量限為：10 μg·mL-1。

3.3 準(zhǔn)確度、精密度與提取回收率

按照“3.2”項(xiàng)下“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作”方法處理，配制低、中、高三個(gè)不同濃度點(diǎn)（梔子苷的含量分別為20、50、80 μg·mL-1）的含梔子苷腸灌流液樣品，每個(gè)濃度點(diǎn)平行配制5份樣品，連續(xù)測(cè)定3天，并依據(jù)當(dāng)日制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各質(zhì)量控制樣品的日內(nèi)及日間精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果表明，本方法精密度和準(zhǔn)確度符合生物樣本測(cè)定要求（見表1）。

表1 含梔子苷腸灌流液樣本HPLC法測(cè)定日內(nèi)、日間精密度以及準(zhǔn)確度結(jié)果

按照“3.2”項(xiàng)下“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作”方法處理，配制低、中、高三個(gè)不同濃度點(diǎn)（梔子苷的含量同上）的含梔子苷腸灌流液樣品，按“2.2.5”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣，以測(cè)得的峰面積與相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣所得峰面積相比較，計(jì)算提取回收率。結(jié)果表明，梔子苷在各質(zhì)量濃度下的提取回收率分別為：94.86%、92.07%、91.93%。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

方法學(xué)穩(wěn)定性試驗(yàn)主要考察空白腸灌流液加入梔子苷室溫放置8 h，3次凍融循環(huán)，-20℃冰柜中放置10天的穩(wěn)定性，以及處理后樣本4℃進(jìn)樣器放置的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，樣本在存儲(chǔ)以及測(cè)定過程中穩(wěn)定，樣本處理后放置進(jìn)樣器內(nèi)12 h無明顯變化。

藥物在灌流液中的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)主要考察梔子苷在腸灌流液中37℃保溫前和保溫后3 h的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，相同濃度的梔子苷在37℃腸灌流液中3 h內(nèi)所測(cè)得的峰面積基本保持不變。

3.5 單味梔子與各配伍湯劑中梔子苷吸收的比較

采用重量法公式計(jì)算各組的吸收速率常數(shù)（Ka）和小腸有效滲透系數(shù) （Peff）， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （見表2）經(jīng)SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果：ZZHPD、ZZHP、ZZ-ZS灌流液組分別與ZZ灌流液組比較吸收參數(shù)均有顯著性差異，表明梔子配伍枳實(shí)和/或厚樸對(duì)梔子苷的吸收有促進(jìn)作用；ZZ-HP灌流液組與ZZ-ZS灌流液組相比較，吸收參數(shù)無顯著性差異，表明枳實(shí)與厚樸對(duì)于梔子苷的吸收促進(jìn)作用程度相當(dāng)；ZZHPD灌流液中梔子苷的吸收程度較ZZ-HP灌流液組或ZZ-ZS灌流液組有所下降，表明梔子厚樸湯全方中梔子苷的吸收程度較單味梔子湯劑中梔子苷吸收程度的提高，可能是枳實(shí)或厚樸各自作用綜合起效的結(jié)果。

表2 ZZ、ZZ-HP、ZZ-ZS、ZZHPD配伍對(duì)于腸灌流液中梔子苷的吸收速率常數(shù)（Ka）和有效滲透系數(shù)（Peff）的影響（n＝6，±s）

表2 ZZ、ZZ-HP、ZZ-ZS、ZZHPD配伍對(duì)于腸灌流液中梔子苷的吸收速率常數(shù)（Ka）和有效滲透系數(shù)（Peff）的影響（n＝6，±s）

注：與 ZZ 灌流液組比較，*P＜0.05；Ka為 K1～K8的平均值

組別Ka（min-1，×10-3）Peff（cm·min-1，×10-4）ZZ灌流液 2.81±0.12 2.69±0.12 ZZ-HP灌流液 3.13±0.10* 3.02±0.11*ZZ-ZS灌流液 3.17±0.06* 3.06±0.06*ZZHPD灌流液 2.96±0.10* 2.83±0.10*

4 討 論

本實(shí)驗(yàn)選用大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并且根據(jù)人用劑量折算大鼠服藥劑量。制備ZZ、ZZ-ZS、ZZ-HP、ZZHPD四組含有梔子的方藥不同配伍湯劑[8]，并對(duì)其中梔子苷含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示：四組湯劑中梔子苷含量分別為：1662.7、1725.9、1790.6、1622.4μg·mL-1。梔子厚樸湯用量是梔子藥材9 g，以梔子厚樸湯全方即梔子苷含量1622.4 μg·mL-1計(jì)算。根據(jù)人與大鼠體表面積折算比例計(jì)算，人（60 kg）用劑量約為大鼠（200 g）給藥劑量的1/6倍[9]。本實(shí)驗(yàn)采用的大鼠體重為（200±20）g，大鼠日用量約為 32.45 mg·kg-1，則 100 mL 灌流液的濃度約為 65 μg·mL-1。

中藥為多種成分組成的共存體，含色素較多，可能會(huì)干擾紫外分光光度法測(cè)定腸灌流液中酚紅濃度，因而不宜使用酚紅法校正小腸對(duì)水分的吸收。另外，關(guān)于離子型藥物酚紅的小腸吸收研究已有相關(guān)報(bào)道[10]，用其作為小腸不吸收物質(zhì)進(jìn)行腸灌流液體積矯正的方法會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)造成誤差。因此，本實(shí)驗(yàn)采用國(guó)際上常用的大鼠在體單向腸灌流模型，研究梔子厚樸湯方劑配伍對(duì)梔子苷吸收的影響，采用重量法校正。由于小腸對(duì)水分吸收所造成的灌流液體積變化，方法簡(jiǎn)便可行，穩(wěn)定性和重復(fù)性好。重量法進(jìn)行腸灌流過程中往往需要密度校正，因?yàn)楣嗔饕菏呛袠悠返囊欢舛鹊柠}溶液，而且經(jīng)過小腸灌流，小腸會(huì)有分泌物或者小腸黏膜脫落，所以流出液的密度大于1。但是本實(shí)驗(yàn)用的灌流速度（0.2 mL·min-1）接近大鼠小腸正常的蠕動(dòng)速度[11]，小腸黏膜幾乎不脫落，因此，灌流液流經(jīng)腸道密度可以認(rèn)為不發(fā)生變化。

許多研究表明，中藥配伍有減毒增效作用，而中藥配伍的研究主要集中在研究配伍改善活性成分的溶出和藥理效應(yīng)上，本文從吸收的角度研究了中藥配伍的優(yōu)效結(jié)果，結(jié)果顯示，主要藥效物質(zhì)梔子苷在配伍湯劑中的小腸吸收參數(shù)與單味藥材湯劑相比有明顯的提高，提示中藥配伍可增強(qiáng)某些活性成分的吸收。枳實(shí)中含有大量柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等黃酮苷類成分，有報(bào)道稱其在人體的吸收機(jī)制是經(jīng)腸道菌群代謝為黃酮苷元后經(jīng)腸道吸收入血[12]，梔子苷與其有相似的吸收機(jī)制，因此推測(cè)枳實(shí)與梔子合用會(huì)競(jìng)爭(zhēng)腸道菌群代謝，進(jìn)而使得梔子苷的腸道局部濃度相對(duì)增加，致吸收增加。方中厚樸與枳實(shí)均對(duì)梔子苷的吸收表現(xiàn)出促進(jìn)作用，由此可見，梔子厚樸湯中特征化學(xué)成分的藥理作用并非單味藥材相應(yīng)作用的簡(jiǎn)單加合，而是方藥相互作用、綜合起效的結(jié)果，在一定程度上說明了中醫(yī)復(fù)方配伍用藥的意義所在。

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