有氧運動對糖尿病大鼠肝臟微量元素及肝細胞組織形態(tài)結構的影響

張勝林，王東良，龔 云，李 敏

(1.蘭州理工大學體育部，甘肅 蘭州 730050;2.甘肅省體育科學研究所，甘肅 蘭州 730050;3.西北師范大學體育學院，甘肅 蘭州 730070;4.甘肅省西和縣蘇合中學，甘肅 隴南 742100)

糖尿病(Diabetes mellitus DM)是一種由于胰島素分泌相對或絕對不足所導致的代謝紊亂綜合癥狀群，微量元素(Trace elements)的代謝受損也囊括其中，微量元素對胰島素的合成、分泌、貯存、活性有很大的影響，同樣胰島素不足也影響微量元素的體內(nèi)平衡狀況;肝臟是各種營養(yǎng)物質(zhì)代謝的中心臟器，而肝臟與胰腺在解剖學、內(nèi)分泌學、胚胎學上關系非常密切，成為唇齒相依如影相隨的臟器，因而患有糖尿病者，難免涉及肝臟。糖尿病患者肝臟病理形態(tài)學改變有3種主要的表現(xiàn):肝腫大、肝臟脂肪浸潤和肝硬化，此三種形態(tài)學改變有可能成為失控的糖尿病病程進展的時間性演變，此種演變過程純系糖尿病引起肝臟組織學及功能的改變。運動是治療糖尿病的“三駕馬車”之一，是治療糖尿病的一劑良藥，但同時也是一柄雙刃劍，這主要決定于運動時間、運動量和運動強度。所以，本課題選擇有氧運動(Aerobic exercise)作為治療糖尿病的干預手段，觀察8周末糖尿病大鼠的血糖(Glu)和血清胰島素(Ins)水平，判斷有氧運動抗糖尿病效果，進而觀察有氧運動對糖尿病大鼠肝臟微量元素代謝紊亂的影響和肝臟組織細胞形態(tài)結構的變化，為糖尿病性肝病的治療提供實驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品

鏈尿佐菌素，檸檬酸，檸檬酸鈉(sigma公司產(chǎn)品)，血糖試劑條(北京麥邦科技有限公司產(chǎn)品)。

1.2 實驗對象

選用體重160-180g 8周齡健康雄性Wistar大鼠50只(蘭州大學醫(yī)學院實驗動物中心提供)，國家標準嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)。動物室溫度18-28℃，相對濕度40%-70%，自然通風光照，飼養(yǎng)室、用具每周紫外線消毒一次。

1.3 動物建模及分組

實驗大鼠適應性喂養(yǎng)一周后禁食12-16小時(不禁水)，進行糖尿病建模。隨機抽取10只作為對照組，剩余40只作為糖尿病模型組。模型組按60mg/kg［1-2］體重腹腔快速注射 STZ(注射 STZ前，用冷的PH為4.0-4.5的0.1mol/l的枸櫞酸緩沖液溶解后配成2%的溶液)，對照組動物腹腔注射等體積0.1%枸櫞酸鹽緩沖液。注射STZ 48h后，連續(xù)3天同一時間測空腹血糖(尾靜脈取血)。若血糖穩(wěn)定升高，一周后，大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、多食、體重明顯減輕，復測血糖≥16.67mmol/l就判定為建模成功［3］。在糖尿病建模成功后隨機將模型組動物分為:糖尿病組20只(DM)，糖尿病有氧運動組20只(DMS)。

1.4 運動方案

采用Bedford跑臺訓練方法。正常對照組，正常籠內(nèi)生活不運動;其余進行一周跑臺適應性訓練，強度由15m/min(持續(xù)15min)，逐漸增加到20m/min(持續(xù)30min)。此后糖尿病安靜組和正常對照組不參與運動，正常籠內(nèi)生活;糖尿病運動組進行持續(xù)6周的正規(guī)訓練，時間30min，強度25m/min。每天訓練一次，每周六天，均在下午16:00-18:00時訓練，坡度為零，訓練期間，每周測一次體重，并觀察飲食變化和精神狀態(tài)。訓練開始后，大鼠自由飲水、自由進食，大鼠跑臺訓練安排［1］見表1。

表1 大鼠跑臺訓練安排一覽

1.5 實驗標本的制備

1.5.1 實驗動物處死及血液標本的制備

為了減小運動對測試指標的影響，在最后一次運動結束后禁食12小時左右稱大鼠體重，依次用2%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉，腹腔采血，抽取6ml注入試管中，全部血樣2h內(nèi)，在4℃以下3 000r/min離心10min棄上層血漿，留血清于-20℃保存，待測血糖、血清胰島素。

1.5.2 肝臟標本的制備

大鼠處死后，迅速取其肝臟，濾紙拭干血漬稱重，切取1cm2見方的肝組織放于10%中性福爾馬林固定液中，固定數(shù)小時等其稍硬再行修切成1×1×0.3cm的小塊繼續(xù)固定。

再切取1-2g肝組織用去離子水洗漂洗數(shù)次，于烘箱中烘干，置干燥器中備用。

1.6 測試指標及方法

從動物建模當日到實驗結束處死前于每日上午更換飼料時，用電子稱測定并記錄每只大鼠體重。實驗前建模時的血糖(Glu)用血糖儀由斷尾采血測定。實驗結束后血糖采用全自動生化分析儀測定。血清胰島素(Ins)放射免疫法。肝臟微量元素Fe、Zn、Cu、Mn由蘭州大學草原生態(tài)研究所采用原子吸收法測定。肝臟組織細胞形態(tài)結構的變化使用HE染色。

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學處理

2 實驗結果

2.1 實驗前后大鼠體重和血糖的變化

本實驗在表2中明確顯示，各組實驗大鼠的體重在實驗前和實驗末發(fā)生了明顯的變化。與實驗前相比，正常對照組(N)體重變化非常顯著(P＜0.01)，而糖尿病模型組體重變化較為顯著(P＜0.05);實驗末與DM組相比，N組體重增加非常顯著(P＜0.01)，DM組體重增加比較顯著(P＜0.05)。

表2 各組大鼠實驗前后體重的變化

由表3可知，正常對照組大鼠實驗前后血糖在正常范圍內(nèi)波動.糖尿病模型組實驗前和實驗末血糖表現(xiàn)出非常顯著的變化(P＜0.05，P＜0.01)。在實驗末與DM組相比DMS血糖有所降低(P＜0.05)。

表3 各組大鼠實驗前后血糖的變化

2.2 有氧運動對糖尿病大鼠血清胰島素的影響

在實驗末，各組實驗大鼠血清胰島素含量各異。表4顯示，與N組相比DM組和DMS組血清胰島素含量非常顯著性降低(P＜0.01)，與DM組相比N組非常顯著性升高(P＜0.01)，DMS組升高較顯著(P＜0.05)。

表4 有氧運動對糖尿病大鼠血清胰島素的影響

2.3 有氧運動對糖尿病大鼠肝臟組織微量元素Fe、Zn、Cu、Mn 的影響

有研究表明在糖尿病時存在著微量元素受損現(xiàn)象，由表5可知，與N組相比Fe、Zn在糖尿病時呈降低趨勢(P＜0.05，P＜0.01)，而Cu的含量與N組相比DM組增高非常顯著，但在DMS組在有顯著降低(P＜0.05)，Mn在各組間并未出現(xiàn)顯著性變化。

表5 各組實驗大鼠腎臟微量元素變化的比較

2.4 有氧運動對糖尿病大鼠肝臟細胞組織形態(tài)結構變化的影響

從圖1-圖6可知，正常對照組(N)肝臟細胞結構完整清晰，肝小葉結構正常，肝細胞無脂肪變性等異常改變。糖尿病模型組(DM)有極少量的脂肪變性，表現(xiàn)為肝小葉界限不清，肝細胞索排列輕度紊亂，大部分肝竇消失，且有壞死細胞，肝細胞——呈圓形，胞漿內(nèi)可見大小不等、數(shù)量不一的脂滴溶液(脂肪變性)，且有散在的嗜酸變性。糖尿病有氧運動組有散見肝細胞顆粒變性和嗜酸變性以及少量脂肪變性，未見壞死，肝小葉結構較糖尿病組有所恢復，細胞結構較為完整，細胞索排列較規(guī)則。

3 討論

正常情況下，機體受各種因素的調(diào)節(jié)血糖處于動態(tài)平衡狀態(tài)，從而維持血糖濃度的相對穩(wěn)定。糖尿病時由于胰島素的分泌缺乏或胰島素作用不足而引起的持續(xù)高血糖的疾病，其威脅在于持續(xù)性高血糖的發(fā)生波及全身的慢性并發(fā)癥，如糖尿病性脂肪肝。

運動可以促進骨骼肌對葡萄糖的直接攝取，使血糖降低，提高胰島素靶細胞的敏感度。運動還會持續(xù)消耗肌糖原與肝糖原，使高血糖狀態(tài)緩解，運動后血糖又轉變成糖原儲存起來，使血糖持續(xù)下降，從而改善胰島素的利用率。Boule等［4］通過14項臨床試驗分析發(fā)現(xiàn)，在體重不減輕的情況下，50%—60%最大攝氧量的踏車練習使T2DM患者的GhbA1水平下降0.66%。Kelley等［5］發(fā)現(xiàn)葡萄糖輸注速率在運動后顯著高于運動前休息狀態(tài)，提示運動能增加Ins誘導的葡萄糖利用率。

在本實驗中正常對照組大鼠實驗前后血糖變化甚微(P＜0.05);在糖尿病模型組實驗前和實驗末血糖表現(xiàn)出明顯的變化(P＜0.05，P＜0.01)，這說明血糖是反映糖尿病最簡單的指標，可使糖尿病與非糖尿病區(qū)別開來。在本實驗中經(jīng)有氧運動干預后糖尿病模型組內(nèi)部血糖也表現(xiàn)出明顯的變化，與糖尿病組(DM)相比糖尿病有氧運動組降低最為顯著(P＜0.01)，血清胰島素卻呈現(xiàn)出相反的趨勢，糖尿病組最低(P＜0.01)。經(jīng)有氧運動干預后出現(xiàn)了一定的顯著性變化，胰島素呈升高趨勢，據(jù)此可以看出有氧運動可改善糖尿病大鼠胰島素狀況，有利于糖尿病的治療。

大量的實驗研究和臨床已證明糖尿病時機體內(nèi)存在微量元素代謝受損現(xiàn)象［6］，近年來在治療糖尿病的過程中也發(fā)現(xiàn)一些微量元素具有胰島素般降糖效應，而胰島素要發(fā)揮降糖作用也必須依賴某些微量元素［4］;所以胰島素分泌的絕對或相對不足影響微量元素在人體內(nèi)的平衡，而微量元素對胰島素的合成、分泌、貯存及能量代謝也起著重要作用。鐵(Fe)是動物組織中含量豐富的微量元素之一，其主要存在于骨骼肌的鐵蛋白、含鐵血黃素和肌球蛋白中，鐵在正常情況下，排出體外的量非常少，主要是通過改變小腸黏膜對鐵的吸收量來進行調(diào)節(jié)的，以保持其含量恒定。本實驗結果顯示，糖尿病組鐵含量明顯低于正常對照組，與臨床檢測糖尿病患者全血中鐵含量降低的報道一致;但在糖尿病有氧運動組Fe的含量依舊在降低，這是因為有氧運動所導致的缺鐵還是其它機制所使，目前還不清楚。鋅(Zn)是許多重要代謝通路中酶的基本成分，存在于核酸和骨組織中，缺鋅可引起胰島素顆粒減少，分泌障礙和增加組織對胰島素作用的抵抗［7］。鋅還可以影響葡萄糖在體內(nèi)的平衡過程，并通過激活羧肽酶B促進胰島素原轉變?yōu)橐葝u素，Zn的缺乏與胰島素分泌的減少以及組織對胰島素作用的抵抗有關［8］。我們發(fā)現(xiàn)M組肝臟組織中Zn含量明顯低于對照組(N)，這可能與DM時胰島素分泌絕對缺乏有關，其具體機制有待進一步研究。

Cu和Mn是過渡金屬元素，其化學性質(zhì)也較為相似，Cu是參與人體多種酶合成、活化代謝的必需微量元素。它與其他元素一起有助于神經(jīng)周圍的阻斷性髓鞘的合成。有實驗報道［9］DM患者血清Cu明顯高于健康對照組水平，這一結果和本實驗研究相一致，糖尿病組Cu含量明顯高于正常對照組，但在糖尿病有氧運動組含量非常接近正常對照組，這與有氧運動、操作的規(guī)范還是與糖尿病的自愈有關，還需進一步探討。諸多報道顯示錳(Mn)與糖代謝異常有關，這與本實驗結果一致。

糖尿病是脂肪肝主要的病因之一，脂肪肝發(fā)生于脂肪過程浸潤，浸潤的脂肪又不能被消耗運往他處，于是形成脂肪微滴，散布于肝中，脂肪浸潤的過程先從肝小葉周邊開始，以后逐漸擴散到整個肝小葉，凡經(jīng)過治療的糖尿病病人的肝周圍細胞胞質(zhì)內(nèi)，含較豐富的糖原，但在中央細胞中糖原減少或缺失，最常見細胞核內(nèi)糖原沉積著的空泡，此種核的空泡更多見于胞質(zhì)糖原最少的細胞。顯微鏡下可見庫普弗細胞腫大，并充滿大小不等的脂肪滴，將細胞核推向一邊，這些現(xiàn)象主要由于胰島素分泌不足導致脂肪異常增加，其中以中性脂肪更為突出［10］。在本實驗中正常對照組(N)肝臟細胞結構完整清晰，肝小葉結構正常;肝細胞無脂肪變性等異常改變。糖尿病模型組(DM)有少量的脂肪變性，表現(xiàn)為肝小葉界限不清，肝細胞索排列輕度紊亂，大部分肝竇消失，且有壞死細胞，胞漿內(nèi)可見大小不等數(shù)量不一的脂滴溶液(脂肪變性)，且有散在的嗜酸變性，糖尿病運動組散見肝細胞顆粒變性和嗜酸變性以及少量脂肪變性，未見壞死。由此可知，在患糖尿病8周時，大鼠肝臟已有脂肪浸潤現(xiàn)象，進而使肝臟細胞結構破壞、肝竇消失、細胞壞死等脂肪肝癥狀產(chǎn)生，經(jīng)有氧運動干預后這一現(xiàn)象有所緩解。

4 結論

糖尿病時大鼠血糖持續(xù)升高，血清胰島素含量降低，微量元素代謝受損，肝臟組織細胞結構破壞，出現(xiàn)脂肪肝現(xiàn)象。有氧運動可緩解高血糖狀態(tài)提高胰島素含量，部分低糾正微量元素代謝紊亂現(xiàn)象，使肝臟組織細胞結構有所改善明顯遏制了脂肪肝的發(fā)展，從而達到了控制糖尿病的作用。

［1］趙守香，董鵬.糖尿病與運動［J］.中國慢性病預防與控制，2004，12(1):46-48.

［2］李聰然，游雪甫，蔣建東.糖尿病動物模型及研究進展［J］.中國比較醫(yī)學，2005，15(1):59-63.

［3］黃國鈞，黃勤挽.醫(yī)用實驗動物模型-制作與應用［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2008:121-124.

［4］Boule NG，Haddad E，Kenny GP，et al.Effects of exercise on glycemic control And body mass in type 2 diabetes mellitus:a meta-analysis of controlled cinical trials［J］.JAMA，2001，286(10):1218-1227.

［5］Chu YJ ，Liu QY ，Hou C ，et al.Blood selenium concentration in resit dents of areas in China haying a high incidence of lung cancer［J］.BiolTrace Element Res ，1984(6):133.

［6］龔云，李敏，亢建國.有氧運動以及補充靈芝多糖抗糖尿病大鼠睪丸脂質(zhì)過氧化機制的探討［J］.甘肅聯(lián)合大學學報，2010(4):79-82.

［7］孫燕，朱本章.微量元素與糖尿病氧化應激［J］.國外醫(yī)學:醫(yī)學地理分冊，2004，25(4):159-161.

［8］薛殿凱.糖尿病患者缺少哪些微量元素［J］.食品與生活，2002(10):26-27.

［9］沈興平，舒昌達，何軍.糖尿病大鼠肋間肌微量元素與氧化應激變化的研究［J］.中國病理生理志，2008，24(3):599–601.

［10］蔡永敏，楊辰華，王振濤.糖尿病臨床診療學［M］.上海:第二軍醫(yī)大學出版社，2006:274-278.